内脂素、CD195、CD30及RORα水平与桥本甲状腺炎甲状腺功能减低的相关性分析

袁晓岚，汪琳姣，王 为，席 巍

(南通大学附属海安医院内分泌科，江苏南通 226600)

桥本甲状腺炎(HT)是临床最为常见的一种慢性淋巴细胞性甲状腺炎(CLT)，其会导致患者甲状腺细胞受损，从而发生甲状腺功能减退(简称甲减)[1]。今年来，随着人们普遍食用含碘食盐和生活方式的变化，HT的发病率呈现出逐年升高的趋势，已经成为原发性甲减最主要的致病原因，而且HT还与甲状腺癌发病率的升高有关[2]。HT的发病机制较为复杂，与环境因素、遗传因素、自身免疫调节等众多因素有关，特异性淋巴细胞在抗甲状腺球蛋白(Tg) 自身免疫启动后会迁移至甲状腺，使甲状腺滤泡细胞(TFC)表达在干扰素-γ(IFN-γ)的诱导下表达大量可导致炎症反应进一步被放大的组织相容性复合体(MHC) Ⅱ类分子，使甲状腺组织被具有致活化作用的巨噬细胞、浆细胞、淋巴细胞等大量浸润，自身免疫反应被激活，导致甲状腺细胞被破坏[3]。在这一免疫机制中，脂肪因子、细胞因子和淋巴细胞转录因子都被认为发挥了重要的介导和调节作用。内脂素是一种由脂肪细胞分泌的参与机体糖脂代谢过程的脂肪因子，有研究显示其有可能还参与了HT患者的免疫调节过程[4]。维甲酸相关孤核受体α(RORα)是2型固有免疫淋巴细胞(ILC2)的特征性转录因子，研究指出,ILC2水平与HT患者Th2细胞活化状态密切相关[5]。CD195、CD30为CD4+T淋巴细胞特异性表面因子，二者水平则与甲状腺局部免疫紊乱情况有关[6]。基于上述研究，笔者则对血清内脂素、细胞因子CD195、CD30及RORα mRNA水平与HT伴甲减至今的相关性进行研究和探讨，以进一步明确HT发病的免疫学机制，进而为临床免疫学机制干预手段的选择和应用提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年3月至2017年12月在本院接受治疗的54例HT伴临床甲减患者、52例HT甲状腺功能正常分别作为HT甲减组、HT功能正常组研究对象，选择同期在本院进行体检的46名健康志愿者作为健康对照组。HT诊断标准：同时满足以下3项条件即可确诊：(1)甲状腺弥漫性肿大，经B超证实且无结节；(2)甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)检测呈阳性；(3)甲状腺显像可见不规则的稀疏和浓集区域。以血清游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)水平低于正常低限值，总促甲状腺激素(TSH)超过正常上限值确定为甲状腺功能减退。患者均为未接受过甲状腺激素治疗的首诊患者。排除标准：(1)存在精神功能障碍者；(2)不符合上述诊断标准者；(3)已接受过相关治疗，可能影响本研究结果者；(4)心电图存在明显心肌缺血改变或伴有严重缺血性心脏病者；(5)存在肾上腺皮质功能异常者；(6)合并严重肝、肾功能疾病者；(7)孕妇及哺乳期者。健康对照组志愿者则无高血压、糖尿病、冠心病、心瓣膜病呼吸系统疾病、神经核精神障碍、肿瘤、甲状腺疾病、自身免疫性疾病及家族史。HT甲减组中，男15例，女39例；年龄20～70岁，平均(42.15±4.63)岁。HT功能正常组中，男14例，女38例；年龄20～70岁，平均(41.96±5.02)岁。健康对照组中，男10例，女36例；年龄20～70岁，平均(43.01±4.07)岁。3组研究对象性别构成、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获得医院伦理委员会审核批准，入组患者及健康志愿者知情并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1血清甲状腺功能及抗体检测 抽取所有患者和健康志愿者的清晨空腹静脉血，静置30 min后离心机3 000 r/min离心10 min，分离获取血清，置于-20 ℃冰箱中保存待测。血清FT3、FT4、总三碘甲腺原氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4)、TSH和血清TGAb、TPOAb、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)的检测均采用电化学发光免疫分析法进行，检测仪器为德国罗氏诊断有限公司的Cobase 411全自动化学发光检测仪，配套试剂盒及质控血清均来自于罗氏公司，严格按照说明书要求进行操作。

1.2.2细胞因子CD30、CD195检测 抽取所有患者和健康志愿者的外周血，应用磷酸盐缓冲液(PBS)以1∶1比例进行稀释，取含有等体积淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)的圆底离心管，2 000 r/min离心15 min后收集单个核细胞层，用Hank′s液洗3次，1 500 r/min离心5 min。加入RPMI 1640培养液(美国GibcoBRL公司)调节细胞浓度为1×106/mL，加入PHA，调节终质量浓度为100 μg/mL，放置于37 ℃、50 mL/CO2孵箱中培养，48 h后收集细胞，检测CD30和CD195细胞。用PBS液对收集的细胞进行洗涤重悬，加入藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD30(深圳晶美生物工程有限公司)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD195(深圳晶美生物工程有限公司)，以不加抗体的标本阴性对照。吹吸混匀后置于4 ℃下孵育45 min，PBS液洗涤2次，1 000 r/min离心10 min，残留液体吸尽，沉淀弹散后在各管中加入1%多聚甲醛PBS 400 μL固定，保存在4 ℃冰箱中，12 h内应用FACS Scan流式细胞仪(美国BD公司)检测CD30、CD195阳性细胞百分比。

1.2.3RORγ mRNA表达水平检测 收集外周血单个核细胞后用PBS 10 mL洗涤2次，按照Trizol试剂盒说明书进行总RNA提取。在外周血单个核细胞中加入总RNA提取试剂Trizol 1 mL，吹打混匀后，室温下放置30 min。加入预冷氯仿200 μL，充分震荡15 s，室温下放置20 min，4 ℃下3 000 r/min离心15 min，收集上层水相，在其中加入异丙醇500 μL，混匀，室温下放置10 min。4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取下层沉淀用75%无水乙醇1 mL洗涤，4 ℃下2 000 r/min离心10 min，取下层沉淀，室温下干燥至半透明状，用无RNA酶的10 μL DEPC水溶解细胞，提取总RNA，采用Ur-2401紫外分光光度计测定RNA样品的浓度和纯度。采用半定量逆转录聚合酶链式反应(semiRT-PCR) 法测定外周血RORαmRNA表达水平。应用反转录试剂盒进行cDNA合成，操作根据试剂盒说明书进行，总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒均购买自大连宝生物工程有限公司。聚合酶联反应中应用Primer 5.0进行引物设计，RORα、β-actin mRNA的引物序列为RORα：上游为CTG ACG AGG ACA GGA GTA GG，下游为GTG CGC AGA CAG AGC TAT TC，产物长度为214 bp；人β-actin：上游为5′-TCT ACA ATG AGC TGC GTG TGG-3′，下游，5′-GGA ACC GCT CAT TGC CAA TG-3′，产物长度498 bp。引物序列由上海生工生物工程技术有限公司合成。PCR反应条件：94 ℃下预变性5 min；94 ℃下变性5 s，59 ℃下RORα退火30 s，58 ℃下β-actin退火30 s，72 ℃下延伸30 s，循环共计35个；72 ℃下保温5 min。取5 μLPCR产进行1%琼脂糖电泳和溴化乙啶染色，应用BIO-RAD CheniDOC XRS图像分析系统读取条带灰度值，以目的基因和βactin灰度值比值表示mRNA表达的相对值。

2 结 果

2.1各组甲状腺功能指标比较 HT甲减组的血清FT3、FT4、TT3、TT4水平均显著低于健康对照组和HT功能正常组,HT甲减组TSH则显著高于健康对照组和HT功能正常组(P<0.05)，HT功能正常组与健康对照组间FT3、FT4、TT3、TT4比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2各组自身抗体水平比较 HT甲减组TRAb、TPOAb、TGAb均显著高于健康对照组和HT功能正常组，HT功能正常组的TRAb、TPOAb、TGAb也显著高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3各组血清内脂素、细胞因子及RORαmRNA表达水平比较 HT甲减组血清内脂素、 CD195和CD30 阳性百分比及RORαmRNA表达水平均显著高于HT功能正常组和健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)，且HT功能正常组和健康对照组血清内脂素、 CD195和CD30 阳性百分比及RORαmRNA表达水平比较差异也具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4相关性分析 HT甲减组患者血清内脂素、CD30、CD195阳性百分比、RORαmRNA表达水平均与TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明显正相关，与TT4呈明显负相关(P<0.05)，见表4。

表1 各组甲状腺功能指标比较±s)

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与HT功能正常组比较，#P<0.05

表2 各组自身抗体水平比较±s)

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与HT功能正常组比较，#P<0.05

表3 各组血清内脂素、细胞因子及RORαmRNA表达水平比较±s)

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与HT功能正常组比较，#P<0.05

表4 Pearson相关性分析

3 讨 论

HT是临床常见的一种可导致甲状腺功能亢进或减退的甲状腺疾病，可见甲状腺肿大或结节，甲状腺持续免疫炎症持续进展，最终可导致甲减，出现包括畏寒、疲劳、甲状腺肿痛、心率减慢、便秘、抑郁等在内的临床表现，或并发类风湿性关节炎、恶性贫血、干燥综合征等并发症，甚至发生癌变，女性患者多伴有受孕和怀孕困难[7]。流行学研究显示，HT是导致甲状腺功能减退的主要病因，其发病率约为0.1%～10.0%，以女性患者更为常见[8]。HT目前的发病机制尚不明确，临床采取的治疗方式主要为甲状腺激素类药物替代疗法，虽然该种疗法可明显缓解患者的甲状腺肿大，改善其甲状腺功能，但也存在不良反应多、停药易复发等不足，而且无法完全纠正患者的甲状腺功能减退，随着病情发展，多数患者最终往往需接受手术治疗[9]。因此对HT发病机制的探讨有可能为疾病的治疗提供新的途径。

HT患者早期多无临床症状,随病程进展,出现弥漫性甲状腺肿大,早期可伴甲状腺功能亢进(简称甲亢),晚期伴甲减。其中甲亢期患者血清TSH轻微升高，血清TT3、TT4及自身抗体TPOAb、TGAb等阳性。后期有甲状腺组织不断受到破坏而萎缩，最终发生甲减，其血清TSH水平显著升高，FT3、FT4、TT3、TT4水平降低，且血清中TPOAb、TGAb、TRAb持续阳性[10]。本研究结果显示,HT甲减组的血清FT3、FT4、TT3、TT4水平均显著低于健康对照组和HT功能正常组,TSH则显著高于健康对照组和HT功能正常组，而HT功能正常组患者的相关甲状腺激素与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；比较其自身抗体水平可见HT甲减组TRAb、TPOAb、TGAb均显著高于健康对照组和HT功能正常组，HT功能正常组也显著高于健康对照组。提示甲状腺功能正常的HT患者甲状腺激素水平变化不大，而无论甲状腺功能减退还是正常，HT患者的自身抗体水平均明显升高。高表达水平的自身抗体可通过补体、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等途径对甲状腺滤泡产生损伤作用，从而最终导致甲状腺功能减退[11]。

HT属于器官特异性自身免疫性疾病，多种机制参与其发病过程。B细胞的活化是导致甲状腺产生抗体的主要原因，而Th2细胞在该过程中发挥了重要的辅助作用。ILC2是一种固有淋巴细胞，其通过分泌和释放2型免疫应答细胞因子参与了维持Th2优势分化状态的过程，其还对B细胞释放IgE抗体具有促进作用。而RORα则是特征性的ILC2转录因子，其对于ILC2分化和功能的维持意义重大[6]。有学者对HT患者外周血单个核细胞中RORαmRNA的表达水平进行观察，结果显示，相对于健康对照者，HT患者RORα表达水平显著升高，其ILC2细胞活性升高，进一步相关性分析结果显示，RORαmRNA表达水平与血清自身抗体水平呈现明显正相关，其指出RORα的表达可通过影响ILC2活性来进一步影响HT患者自身抗体的产生[12]。本研究结果显示，HT甲减组和HT功能正常组患者的外周血单个核细胞RORαmRNA表达水平显著高于健康对照组，且HT功能正常组也显著高于健康对照组，Pearson相关性分析则显示HT甲减组患者RORαmRNA表达水平均与TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明显正相关，与TT4呈明显负相关。提示RORα的表达水平与HT患者甲状腺功能减退和自身抗体水平密切相关。

CD30、CD195是CD4+T淋巴细胞的特异性表面因子，其中CD30是Th2细胞的优势细胞因子，CD195是Th1细胞的优势细胞因子，二者表达水平的变化可对甲状腺局部Th1、Th2平衡产生影响，可反映出甲状腺局部免疫状态。作为Th2细胞的代表性细胞因子，CD30水表达水平的升高提示体液免疫活跃，在哮喘、Graves病患者中均可见CD30的优势表达[13]。CD195又名CCR5，属于调节性T细胞(Treg)趋化因子受体家族，主要表达于单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞中，参与免疫状态稳定的维持。有研究指出，CD195的高水平表达是诱发HT细胞免疫的重要因素[14]。本研究结果显示，HT甲减组和HT功能正常组患者的CD30、CD195阳性百分比均显著高于健康对照组，且HT功能正常组也显著高于健康对照组，Pearson相关性分析则显示HT甲减组患者CD30、CD195阳性百分比均与TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明显正相关，与TT4呈明显负相关。提示HT患者的甲状腺功能减退与CD30、CD195异常表达而导致细胞免疫活跃有关。

内脂素是新近发现的一种具有模拟胰岛素作用的脂肪因子，同时也是一个促炎症反应因子，具有炎症和免疫特性，在人体获得性免疫和固有免疫系统的调节中具有非常重要的作用。内脂素可对树突状细胞和巨噬细胞的活化状态产生调控，其可诱导T细胞分化为Th2细胞，使辅助B细胞成熟的白介素(IL)-4、IL-5、IL-6等释放增多，从而促进自身抗体产生，介导体液免疫。有研究指出，内脂素水平与甲状腺功能密切相关，当甲状腺功能减退时，体内脂肪组织蓄积，脂肪细胞合成分泌内脂素增加，其血清浓度相应升高，而且其血清浓度与甲状腺功能异常患者血清甲状腺激素水平有关[15]。本研究结果显示，HT甲减组和HT功能正常组患者的血清内脂素水平显著高于健康对照组，且HT功能正常组也显著高于健康对照组，Pearson相关性分析则显示HT甲减组患者内脂素与TSH、TRAb、TGAb、TPOAb呈明显正相关，与TT4呈明显负相关。提示内脂素水平的升高与HT患者甲状腺激素水平的变化和自身抗体水平水平升高有关，但有关其在HT甲状腺功能减退中的价值仍需进一步研究明确。

综上所述，HT甲减患者的血清内脂素、细胞因子CD30、CD195阳性百分比及RORα表达水平均显著升高，其与患者的甲状腺功能及自身抗体水平具有一定的相关性，其作用可能是通过影响调节性 T 细胞趋化因子受体水平和Th2 细胞因子表达，导致自身免疫反应被激活，引起甲状腺细胞破坏，从而最终导致患者发生甲状腺功能减退。