CTLA-4+细胞在急性加重慢性阻塞性肺疾病患者外周血中的表达

常 芬

(武汉市普仁医院呼吸内科，湖北武汉 430081)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以持续性气流受限为特征的呼吸系统疾病[1]。作为一种不完全可逆的气流受限而进行性发展的慢性病，吸烟、遗传及个体易感等多种因素通常被认为与COPD的发生、发展相关，而且随着现代社会的发展及环境污染的日益严重，影响COPD发生、发展的因素也变得多样[2]。从病理及免疫学的角度出发，呼吸道缩窄阻塞的过程通常与一系列复杂的由吸入颗粒物及有害气体所引起的慢性炎性反应密切相关，黏膜下多种炎症细胞浸润及细胞、体液免疫不同程度的改变使气流阻塞成进行性发展[3]。而且COPD的发生、发展过程中会合并严重的并发症，如肺癌、心脑血管疾病、糖尿病等，因此，COPD已成为威胁人民身体健康及生活质量的重要疾病[4-5]，成为受社会广泛关注的健康问题。

曾有相关研究指出，COPD患者1型辅助性T细胞(Th1)的免疫应答在COPD患者中受限，Th1细胞主要通过释放γ干扰素 (IFN-γ) 活化巨噬细胞，增强其杀伤已被吞噬的病原体的能力。细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。调节性T细胞(Tregs)可以持续表达CTLA-4并以此影响效应T细胞。有研究表明，COPD患者的CTLA-4+T细胞及CTLA-4+Treg细胞显著高于健康人[6]，因此，本次研究假设CTLA-4+表达过度是Th1细胞免疫功能障碍的关键环节，并最终导致COPD患者肺部受到细菌性感染，并找到COPD患者Th1细胞功能障碍的关键免疫调节环节，进一步寻找改善患者Th1细胞功能的方法。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年1月至2017年1月于本院收治的40例急性加重慢性阻塞性肺疾病(AECOPD)且无肺部细菌性感染的患者作为病例组，同时选取40例平稳期慢性阻塞性肺疾病(sCOPD)患者作为对照组。入选标准：(1)所有受试者均依照中华医学会《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》确诊[7]；(2)稳定期的判断均按照中华医学会呼吸病学分会及原卫生部医政司相关指南及诊疗规范要求[7]；(3)AECOPD患者除需满足前文所述纳入标准外，需经痰培养确认未合并肺部细菌性感染。排除标准：(1)合并肝脏、心脏、肾脏及血液系统疾病；(2)本研究前2周使用过免疫抑制剂的患者；(3)本研究前2周使用过全身激素的患者。被纳入本次研究的所有研究对象均为汉族，其中AECOPD组男性患者24例，女性患者16例；sCOPD组男性患者22例，女性患者18例。纳入的研究对象人口学特征在组间分布均衡可比。本研究经本院伦理委员会讨论通过，所有患者均知情且自愿参加，并签署了知情同意书。

1.2方法

1.2.1血浆分离制备 对所有研究对象取新鲜外周血，并3 000 r/min离心10 min，上层血清用移液枪吸入EP管中置于超低温冰箱-80 ℃保存待统一酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。将需检测血清从冰箱中取出常温下自然化冻后使用检测试剂检测血清样本中目标成分的水平，使用多功能酶标仪检测。分离后的血浆单核细胞(PBMC)置于10%的胎牛血清中。

1.2.2CTLA-4+细胞比例测定 取sCOPD组及AECOPD组等量PBMC及加入胎牛血清后在37 ℃、5% CO2的条件下倾斜静置24 h，再过2 h加入布雷菲德菌素(1 μg/mL)或莫能菌素(2 μmol/L)加上CTLA-4别藻蓝蛋白抗体，以便检测细胞内及细胞外CTLA-4。清洗细胞后用Fixable Viability Stain 450、CD3-APC-H7、CD4-V500、CD8-Peridinin chlorophyll protein-Cy5.5及CD45RAphycoerythrin-Cy7进行细胞表面着色；同时应用Human Foxp3 buffer sets、Foxp3-phycoerythrin 及CTLA-4-APC抗体进行细胞内染色，后用流式细胞仪进行分析。

1.2.3抗CTLA-4抗体阻断 取等量sCOPD组及AECOPD组PBMC各一份加入抗CD3抗体，再取等量AECOPD组PBMC一份加入抗CD3抗体及抗CTLA-4 抗体，将3份PBMC样本置于96孔平板培养24 h，上层培养物转移并储存在-80 ℃ 冰箱中存储，取出培养物后经自然化冻并应用ELISA法检测其中IFN-γ及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。

1.2.4仪器与试剂 本次研究所使用的离心机为迈达TDM3-120m；检测血清生物标志物所使用的多功能酶标仪为安图斯-PHOMO；流式细胞仪为赛默飞生产的Attune NxT；布雷菲德菌素及莫能菌素来源于BD公司生产的GolgiPlug产品；CTLA-4-APC及Foxp3-phycoerythrin均为 BD公司生产；进行细胞内CTLA-4染色使用的Fixable Viability Stain 450为BD公司生产的Horizon产品；Human Foxp3 buffer sets为BD公司生产的Pharmingen产品；用于细胞培养的抗CD3抗体为Mabtech公司生产；TNF-α的ELISA检测试剂由BD公司生产(557966)；IFN-γ的ELISA检测试剂由Cusabio公司生产(E04577h)。在整个研究过程中，所有操作均按照说明书严格执行，并且所有操作均符合实验室的质量控制标准。

2 结 果

2.1两组患者人口学特征及基础状况分析 对sCOPD组与AECOPD组的人口学特征及基线情况分析发现，两组患者性别、年龄及吸烟比例等人口学特征组间差异无统计学意义(P>0.05)。而标志着系统炎症的血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)及血清可溶性肿瘤坏死因子受体1(sTNFR1)水平在两组间的差异有统计学意义(P<0.05)，AECOPD患者的血清hs-CRP值及血清sTNFR1值均高于sCOPD患者。见表1。

表1 两组患者人口学特征及基础状况分析

注:*表示对数转换后服从正态分布

2.2两组患者CTTLA-4+细胞比例分析 对两组患者外周血细胞的分析可以看出，sCOPD患者Treg细胞在所有CD4+细胞中的比例为4.35%；AECOPD患者Treg细胞在所有CD4+细胞中的比例为5.12%，两组间差异无统计学意义(P>0.05)。sCOPD患者细胞内CTLA-4+细胞在Treg细胞及CD4+细胞的比例分别为54.47%和8.13%；AECOPD患者细胞内CTLA-4+细胞在Treg细胞及CD4+细胞的比例分别为50.14%和7.61%，两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。sCOPD患者表面CTLA-4+细胞在Treg细胞及CD4+细胞的比例分别为8.69%和1.08%；AECOPD患者表面CTLA-4+细胞在Treg细胞及CD4+细胞的比例分别为20.74%和2.31%，两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。AECOPD患者表面CTLA-4+在Treg细胞及CD4+细胞中所占比例均高于sCOPD患者。见表2。

2.3两组患者PBMC经不同方式培养后血清中IFN-γ及TNF-α水平分析 对两组患者PBMC分别加入抗CD3抗体，另取等量AECOPD患者血清加入抗CD3抗体+抗CTLA-4抗体分别培养后测定培养物中IFN-γ及TNF-α水平，发现3组培养物的IFN-γ水平不全相同(P<0.05)。进一步用SNK-q法进行两两比较发现，AECOPD患者PBMC中仅加入抗CD3抗体后获得的培养物中IFN-γ水平显著低于sCOPD患者PBMC中仅加入抗CD3抗体及AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗体+抗CTLA-4抗体所获得的培养物中IFN-γ水平，而AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗体+抗CTLA-4抗体所获得的培养物中IFN-γ水平与sCOPD患者PBMC中仅加入抗CD3抗体所获得的培养物中IFN-γ水平间差异无统计学意义(P>0.05)。同时，通过比较发现3组培养物的TNF-α水平不全相同(P<0.05)。进一步两两比较发现,AECOPD患者PBMC中仅加入抗CD3抗体后获得的培养物中TNF-α水平显著低于sCOPD患者PBMC中仅加入抗CD3抗体及AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗体+抗CTLA-4抗体所获得的培养物中TNF-α水平，而AECOPD患者PBMC中加入抗CD3抗体+抗CTLA-4抗体所获得的培养物中TNF-α水平与sCOPD患者PBMC中仅加入抗CD3抗体所获得的培养物中TNF-α水平间差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 两组患者CTTLA-4+细胞比例分析

注：*表示Wilcoxon秩和检验

表3 两组患者PBMC经不同方式培养后血清中IFN-γ、TNF-α水平分析

续表3 两组患者PBMC经不同方式培养后血清中IFN-γ、TNF-α水平分析

注：*表示对数转化后服从正态分布

3 讨 论

有研究显示，AECOPD的患者合并有细菌感染的比例高达50%，这常常导致病情复杂化并使患者治疗难度增加，对患者病情的控制十分不利[8-9]。病原分离的结果提示，未分型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和莫拉克斯菌属是造成AECOPD患者肺部感染的主要病原体[10-11]。值得注意的是，有研究报道口服未分型流感嗜血杆菌疫苗无法阻止AECOPD患者肺部受到未分型流感嗜血杆菌的感染；同时，AECOPD患者气道浸润的大量活化T细胞同样对AECOPD患者的肺部感染无能为力；而且经痰培养确诊的肺部合并不可分型流感嗜血杆菌(NTHI)感染的AECOPD患者对NTHI P6蛋白的淋巴增殖反应低于不合并NTHI感染的COPD患者[12]。以上事实均说明AECOPD患者的呼吸道免疫功能受到限制。虽有研究证实该现象与COPD患者急性加重期的Th1细胞功能障碍有关[13-14]，但是关于其中的机制性研究还比较匮乏。通过本次研究，可以说明表面CTLA-4+细胞有限制AECOPD患者Th1细胞功能的作用。如果进一步阻断表面CTLA-4+的表达，Th1细胞功能将有所恢复并且血清中IFN-γ与TNF-α的水平均有显著提高。

从sCOPD患者及AECOPD患者外周血PBMC中CTTLA-4+细胞比例分析结果可知，sCOPD患者细胞内CTLA-4+细胞在Treg细胞及CD4+细胞的比例与AECOPD患者细胞内CTLA-4+细胞在Treg细胞及CD4+细胞的比例十分接近；而表面CTLA-4+则不然，sCOPD患者表面CTLA-4+细胞在Treg细胞及CD4+细胞的比例分别为8.69%和1.08%；AECOPD患者表面CTLA-4+细胞在Treg细胞及CD4+细胞的比例分别为20.74%和2.31%，两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。因此，COPD患者急性加重期的Th1细胞功能障碍主要与表面CTLA-4+细胞相关，而非细胞内CTLA-4+细胞，这与其他相关研究所得结论一致[6，15]。而且高比例的表面CTLA-4+也会造成AECOPD患者血清sTNFR1水平高于sCOPD患者。而细胞内CTLA-4+通常与COPD患者呼吸道的长期慢性炎症相关，因此，在两组间未见显著差别。

从基因的角度来看，CTLA-4基因的剪切变异体可以使CTLA-4的跨膜异构体及不能跨膜转移的可溶性异构体表达增加[16]。两种异构体均可由活性CD4+细胞诱导并抑制免疫反应。由于本次研究所使用的抗CTLA-4抗体可以阻断跨模性及可溶性两种异构体的免疫活性。因此，尚需进一步使用针对两种异构体的特异性阻断抗体进行试验以获得进一步的结论。这也是下一步研究的重点。

本次研究结果显示，IFN-γ的水平与CTLA-4+细胞比例呈反比例关系，在加入抗CTLA-4抗体的AECOPD组中IFN-γ的水平有显著升高，提示抗CTLA-4抗体的加入可以恢复Th1细胞的免疫功能。因此，可以降低AECOPD患者肺部细菌性感染的风险，这一结论可以为COPD急性加重时患者的治疗产生有益的提示。