血根碱通过PI3K/AKT信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤

叶桢干，王雪静

2.湖北省咸宁市中心医院，湖北咸宁 437100

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)已经成为世界范围内发病率和死亡率最高的疾病之一。它是由于冠状动脉血流的突然中断，进而导致急性的心肌缺血坏死[1]。到目前为止，一些药物及手术治疗手段，如静脉溶栓、经皮冠状动脉介入及冠状动脉旁路移植术等方法，可以恢复缺血区域的血流灌注，从而有效地缓解心肌缺血并减少梗死面积[2]。然而，再灌注过程可造成心肌细胞的额外损伤，即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia and reperfusion injury, MIRI)。研究表明再灌注损伤所导致的心肌梗死面积约占最终总梗死面积的50%以上[3]。心肌缺血再灌注损伤的机制尚不十分清楚，炎症、氧化应激、钙离子超载、凋亡被认为是其重要的潜在病理机制[4-5]，但是目前针对MIRI的治疗仍不理想。

血根碱是一种广泛存在的二苯甲苯胺生物碱，主要提取自血根草的根中。血根碱具有多种生物学和药理学活性：抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗凋亡等，因此引起了研究者的极大重视[6]。血根碱可以缓解脂多糖诱导的心肌细胞的炎症反应，并抑制心肌细胞的凋亡[7]。因此，本研究将探究血根碱在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其潜在的作用机制。报道如下。

1 材料与方法

1.1动物与实验设计30只野生型SD大鼠(SPF级，体质量200～250 g)购自湖北省疾控中心。大鼠随机分为3组并接受相应的处理：①假手术组(SO组)：左侧开胸，左前降支(left anterior descending,LAD)下穿线不结扎；②I/R组：开胸结扎LAD 30 min，再灌注2 h；③血根碱+I/R组(I/R+ SAN组)：缺血30 min后，通过鼠尾静脉用微量注射器注射血根碱(50 mg·kg-1)，然后再灌注2 h(使用含有0.05% Tween-80的生理盐水溶解血根碱)。大鼠心肌缺血再灌注损伤模型构建方法如下：术前12 h，大鼠禁食不禁饮。腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg·kg-1)麻醉大鼠，仰卧位固定。气管插管连接小动物呼吸机给予人工通气(70次·min-1)。在四肢皮下置入不锈钢电极连接心电图，监测标准Ⅱ导联的心电图变化。左侧开胸暴露心脏，轻轻挑去心包膜。在左心耳与动脉圆锥之间使用6-0丝线在LAD下穿线，在LAD上表面放置一根中部带有凹槽的小聚乙烯管，辅助结扎并保护LAD。以标Ⅱ导联ST段抬高或结扎血管供血区域，心脏颜色由红润变紫绀表明心肌缺血成功。缺血30 min后剪断结扎线，恢复血流灌注2 h。

1.2心肌组织病变的观察摘取心脏组织，置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，然后进行石蜡包埋、切片(厚度为5 μm)，行常规HE染色，通过光学显微镜观察心肌组织病理形态学改变。

1.3乳酸脱氢酶和肌酸肌酶同工酶的检测再灌注2 h结束后，经颈静脉取血，3 000 r·min-1离心15 min，提取上清，全自动生化分析仪测定肌酸肌酶同工酶(creatine kinase,CK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平。具体操作步骤参照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)。

1.4心肌组织中IL-6、TNF-α的检测实验结束后，将大鼠处死后取各组心肌组织，按照ELISA试剂盒的说明检测炎症因子IL-6和TNF-α的表达，使用分光光度计读取各组的吸光度值。

1.5免疫印迹技术检测蛋白的表达Western blot检测各组AKT和p-AKT的蛋白表达水平。使用裂解液(碧云天)裂解心肌组织，离心取上清提取总蛋白。BCA试剂盒(碧云天)检测蛋白浓度。采用10%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白，然后转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭90 min，AKT (Cell signaling, #2938)和p-AKT (Abcam, ab32509) 及GAPDH (Abcam, ab181602) 相对应的抗体4 ℃孵育过夜，之后二抗室温继续孵育1 h。化学发光法显影蛋白条带，使用Image Lab 软件分析目标蛋白的灰度值，以GAPDH为内参标化检测蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1心肌组织的病理在假手术组中，心肌纤维完整且排列规则，心肌细胞形态完整、结构清晰，未发现胞核固缩、坏死及炎症细胞的浸润。在I/R组中，可见心肌纤维部分断裂且排列紊乱，细胞破裂、溶解，核固缩、核溶解、细胞间质水肿和炎症细胞浸润。而SAN+I/R组尽管出现心肌纤维肿胀、萎缩和小部分断裂，但是心肌细胞结构和形态基本保持正常，见图1。

2.2血清LDH和CK的水平I/R组血清中LDH和CK的水平较SO组明显增加(P<0.05)。血根碱预处理组显著降低了缺血再灌注所引起的LDH和CK-MB水平的增加(P<0.05)，见图2。

2.3心肌组织炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平ELISA结果显示，缺血再灌注损伤后，炎症因子IL-6、TNF-α的水平显著提升(P<0.05)，血根碱预处理可以显著抑制炎症因子的表达(P<0.05)，见图3。

SO:假手术组；IR:缺血再灌注组；IR+SAN:IR+血根碱图1 血根碱对心肌病理的影响

A:LDH水平；B:CK-MB水平。①与SO组比较，P<0.05;②与SO或I/R组比较，P<0.05图2 血根碱对血浆中LDH和CK-MB水平的影响

A:IL-6水平；B:TNF-α。①与SO组比较，P<0.05;②与SO或I/R组比较，P<0.05图3 血根碱对心肌组织中IL-6和TNF-α表达的影响

2.4血根碱对心肌组织PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白表达的影响Western blot 结果表明，再灌注过程中心肌组织中p-PI3K和p-AKT的蛋白水平明显下降；血根碱预处理后p-PI3K、 p-AKT的蛋白水平相对于I/R组显著升高(P<0.05)；各组中PI3K和AKT的表达无显著差异(P>0.05)。见图4。

A:PI3K蛋白表达水平;B:p-PI3K蛋白表达水平;C:AKT蛋白表达水平;D:p-AKT蛋白表达水平。①与SO组比较，P<0.05；②与SO或I/R组比较，P<0.05。图4 血根碱对心肌组织中AKT和p-AKT表达的影响

3 讨论

目前为止，最为快速有效治疗AMI 的方式是早期成功地再灌注心肌[2]。然而随之而来的再灌注损伤在很大程度上抵消了其有益作用。虽然在再灌注损伤的病理生理机制上已经取得很大进展，但是仍然缺乏理想的措施缓解其不利影响。炎症反应被认为在心肌缺血再灌注损伤中发挥着关键作用。研究表明，在心肌缺血再灌注损伤过程中，炎症反应导致的损伤贯穿于心肌细胞损伤的全过程，且能够与其他可能参与心肌缺血再灌注损伤的机制(如氧化应激、细胞凋亡等机制)互相作用，是十分活跃的中间媒介[8]。

PI3K/AKT信号通路是一个广泛存在的信号通路，已经被证实参与多种细胞生物过程[9]。AKT是PI3K下游最重要的中心调节分子，其活化形式磷酸化的AKT(p-AKT)，可以进一步与关键的炎症相关分子发生作用，对细胞产生强大的保护作用[10]。之前大量的研究已经证实，PI3K/AKT信号通路的激活，可以显著减轻炎症反应，从而缓解心肌缺血再灌注损伤。Li等[11]的研究发现橙皮苷预处理，可以通过激活PI3K/AKT信号通路，抑制下游关键炎症分子HMGB1的表达，从而对心肌发挥保护作用。而使用该信号通路的特异性抑制剂LY294002后可以阻断这一作用。黄仁彬等[12]同样发现，通过激活PI3K/AKT信号通路，可以显著减少TNF-α炎症分子的表达水平，从而缓解心肌缺血再灌注损伤。最新的研究表明，血根碱可以显著缓解脂多糖诱导的心肌炎症反应，并可以显著抑制IL-6、TNF-α等关键炎症因子的表达，表现出强大的抗炎作用[7]。因此，推测血根碱可能通过减轻炎症反应进而缓解心肌缺血再灌注损伤。

血根碱拥有多重有益于健康的药物功效，研究者已经证实血根碱在白血病、肿瘤、气道重构、心肌肥厚以及心肌炎等的治疗中，具有强大的治疗作用[13-14]。然而，血根碱是否可以在心肌缺血再灌注损伤中发挥积极作用尚不清楚。因此，在本研究中，作者构建了大鼠心肌缺血再灌注损伤模型进行探究。本研究结果表明，给予50 mg·kg-1的血根碱处理后，可以显著减轻缺血再灌注损伤导致的心肌损伤，表现为血根碱可以显著缓解再灌注损伤导致的心肌形态学改变，降低再灌注后血浆中LDH和CK-MB的水平，并降低由再灌注损伤诱导的炎症因子IL-6和TNF-α表达的升高。同时，再灌注损伤引起的PI3K/AKT信号通路的抑制得以显著缓解，具体表现为，与模型组相比血根碱处理后可以显著上调p-PI3K和p-AKT蛋白的表达。由此可见，血根碱有可能成为缓解心肌缺血再灌注损伤的有效治疗手段。

综上所述，血根碱可以缓解心肌缺血再灌注损伤，这种保护作用可能与其激活PI3K/AKT信号通路从而减轻炎症反应有关。