不同血液检测模式下核酸检测试剂有效利用率结果分析

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2017年1月～2018年3月来自某血站的129 955例无偿献血者血液标本。所有无偿献血者均符合我国《献血者健康检查要求》[3]的标准，第一支采用EDTA-K2真空抗凝管采血5ml，用于ELISA检测；第二支采用EDTA-K2带分离胶真空抗凝管采血5mL，用于NAT检测；所有标本均在冷链保证下4 h内完成离心，存放于2～8℃环境下,72 h内完成检测，实际利用率=(实际测试量/实际标定测试量)×100%。

1.2 仪器与试剂

核酸检测系统：NAI筛查和确证系统采用罗氏Cobas s201核酸检测系统(美国罗氏公司)，全自动核酸扩增系统：Hamilton STAR全自动混样仪、Cobas Taqmen Analyzer核酸扩增检验仪、Cobas Ampilp rep核酸提取仪，试剂：Cobas TaqScreen MPX；ELISA采用Freeedom evo 200 全自动加样仪，筛查剂:HBsAg、抗-HCV及抗-HIV；BEPⅢ酶免疫分析仪；KUBOAT 8420低速离心机；MPR2141OR冰箱。

1.3 方法

NAT检测：采用CHITAS BSS1200(核酸汇集+提取)+ABI 7500(核酸扩增)技术对样本混合检测，每个一级混样池包含6个纳入NAT检测的无偿献血样本，取每个样本中的167μL血浆到一级混样池，采用全自动混样仪加样，应用MGP磁珠分离技术原理于全自动核酸提取仪中提取核酸，采用核酸扩增检验仪进行HBV、HCV、HIV靶序列扩增检验，观察并记录服务器所判读的结果。酶联免疫吸附测定(ELISA)：采用TECAN全自动加样仪自动加样，两种试剂的2次检测采用FAME进行(均严格按仪器和试剂盒的要求进行操作)，每组检测均设置对照，且每一级混样池均含内对照(IC)，将全自动核酸提取和扩增检测系统检出的阳性、混样池拆分为6个组，组成该一级混样池的原始样本做单样本检，检测为阴性判定为NAT阴性，阳性判定为NAT阳性。

1.4 统计学方法

选用统计学软件SPSS19.0对研究数据进行分析和处理，计数资料采取%表示，行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NAT总体检测结果

共完成NAT检测129 955例，有反应性199例，阳性率为0.15%(199/129 955)，混样阳性的进行拆分单检，有反应性55性例，拆分阳性反应率为27.64%(55/199)，其中HBV DNA占NAT拆分阳性率的90.91%(50/55)，HCV RNA 2例，HIV RNA 3例，试剂总的损耗率为0.22%(296/129 955)，实际测试量为129 659例，利用率为99.77%(129 659/129 955)。

2.2 ELISA总体检测结果

共完成ELISA检测129 955例，有反应性180例，阳性率为0.14%(180/129 955)，混样阳性的进行拆分单检，有反应性50性例，拆分阳性反应率为27.78%(50/180)，其中HBV DNA占拆分阳性率的80.00%(40/50)，HCV RNA 3例，HIV RNA 7例，试剂总的损耗率为0.22%(296/129 955)，实际测试量为129 655例，利用率为99.77%(129 659/129 955)。

2.3 未能完全使用的296套试剂原因分析

未能完全使用的296套试剂中混检假阳性率占13.51%，无效孔、日常内部质控和每季度进行的实验室内部空气监测均占20.27%，参加卫生部室间质评占16.89%，内部质控失控导致的整个批次无效占29.05% 。见表1。

表1 未能完全使用的296套试剂原因分析 n(%)

3 讨论

输血相关传染病的预防和控制是全社会关注的焦点之一[1]。NAT是一种新兴的血液传染病检测方法，其主要原理是：利于化学、物理、生物学等方法，通过其附带信号、靶核酸直接扩增的方法，将看不见的极微量的核酸变成直观的可视信号或光、电，从而判断是否存在相应的病原体[2]。2010年，国家卫生与计划生育委员会确定在全国15家供血机构开展NAT试点工作，以保证血液检测质量。NAT检验技术被越来越多的国家和地区采用，能够降低HBV、HCV、HIV的传播风险，提高临床输血的安全性[3，4]。

有研究表明NAT可明显缩短病毒检测的窗口期，且不受病毒差异等和个体免疫因素的影响。由于自动化NAT系统的试剂价格较高，因此如何在确保检测质量的情况下降低检测成本，提高利用率，为大家所关注。本研究结果显示试剂总的利用率为99.77%，有反应性199例，阳性率为0.15%，混样阳性的进行拆分单检，有反应性55性例，拆分阳性反应率为27.64%，其中HBV DNA占NAT拆分阳性率的90.91%，提示这部分献血者具有比正常献血者HBV感染的风险更高，对非反应的试剂，要求采用更合理的检测策略。ELISA检测阳性率为0.14%，其中HBV DNA混检阳性率为0.03%，HCV RNA 3例，HIV RNA 7例，提示对ELISA对HBV感染的阳性检出率较低，ELISA操作步骤复杂，影响反应因素较多，因此对HBV感染的阳性检出率较低，本研究结果显示试剂损耗率为0.28%，而影响试剂损耗的因素有：混检假阳性率、无效孔、日常内部质控(包括阴阳性对照和室内质控各一孔/每批次)、参加卫生部室间质评、每季度进行的实验室内部空气监测、内部质控失控导致的整个批次无效。其中内部质控失控导致的整个批次无效占29.05%，对于试剂损耗应该优化工作流程，设计好检测计划，因NAT的检测过程非常精密，在使用中，软件、仪器的硬件均可能导致失败，从而导致试剂的浪费，消耗未加入检测试剂的记载时间，最终降低了试剂的利用率，因此，为提高试剂的利用率，需要根据实际检测量与厂家密切联系，加强仪器保养，提高操作的熟练度和标本管理能力，注重实验室的防治污染，做好实验室环境以及仪器的内部清洁、消毒工作，以防治污染导致无效检测。

综上所述，不同血液检测模式下核酸检测试剂有效利用率无明显差异，应用NAT可降低输血风险，尤其对HBV感染的阳性检出率较高。同时核酸检测试剂的成本颇高，因此减少试剂的浪费十分重要，需研究更好的办法来提高试剂的利用率。