参葵通脉颗粒含药血清对H2O2致乳鼠心肌细胞损伤的保护作用

方慧华， 严士海， 周仲瑛， 李七一

（1.南京中医药大学附属医院药学部，江苏南京 210029；2.南京中医药大学附属医院药理室，江苏南京 210029；3.南京中医药大学附属医院心内科，江苏南京 210029）

虽然目前对慢性心力衰竭的治疗取得了重大进展，但其发病率和死亡率仍然非常高，代谢功能障碍是该疾病的重要基础机制[1-2］，氧化应激可导致心肌细胞结构损伤和功能紊乱，是慢性心衰、心肌重塑、心肌缺血再灌注等多种心血管疾病发生发展的关键环节[3］。参葵通脉颗粒是课题组传承国医大师周仲瑛教授治疗慢性心力衰竭临床经验所创制的医院制剂，其安全有效，可改善心功能、抗氧化应激[4］。本实验通过心肌细胞氧化应激损伤模型和血清药理学研究方法，观察参葵通脉颗粒对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用，特别是对糖脂代谢紊乱的调控作用，为相关临床治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 新生3 d内SD乳大鼠，雌雄兼有；8周龄SD大鼠，雄性，均由南通大学实验动物中心提供，合格证号SCXK（苏）2014-0001。

1.2 试药 参葵通脉颗粒，组方炙黄芪20 g、灵芝20 g、仙灵脾10 g、桂枝 10 g、丹参 10 g、黄蜀葵 10 g、茯苓10 g、陈皮6 g。将桂枝、陈皮置于减压浓缩罐中，加6倍量水蒸馏提取，收集挥发液，滤取多余煎液；余下6味药与上述2味药的药渣合并，置于多功能提取罐中，加水煎煮2次，第1次加10倍量水浸泡0.5 h后煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20～1.22（70～75℃）的清膏。挥发液二次蒸馏，收集挥发油，乙醇溶解后加入含β-环糊精的饱和水溶液中搅拌3 h，0～4℃下冷藏过夜，抽滤，收集滤饼，40℃下干燥，得包合物。取适量糊精加到包合物中，流化床制粒，70℃下干燥，制粒，即得。由江苏省中医院制剂部提供，批号20170612。二甲基亚砜 （DMSO）、H2O2、胰酶均购于美国Sigma公司；放射免疫沉淀分析裂解液、增强型双金鸡宁酸 （BCA）蛋白浓度检测试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）试剂盒、细胞核蛋白与胞质蛋白抽提试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG均购自于凯基生物科技有限公司；磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 （p-AMPKα）、 腺苷酸活化蛋白激酶 （AMPKα）、 葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）、 脂肪酸转位酶 （FAT／CD36）、 肉毒碱琥珀酰转移酶-1（CPT-1）兔抗大鼠多克隆抗购于美国Cell Signaling公司；乳酸脱氢酶 （LDH）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、丙二醛 （MDA）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器 HF151UVCO2培养箱 （上海力申科学仪器有限公司）；倒置显微镜 （日本 Olympus公司）；净化工作台（上海手术器械厂）；酶标仪 （瑞士Tecan公司）。

2 方法

2.1 含药血清制备 将SD大鼠随机分成4组 （每组10只）：参葵通脉颗粒低剂量组，4.32 g生药／kg，剂量为人临床等效剂量的1／2，取4.32 g溶入10 mL蒸馏水中；参葵通脉颗粒中剂量组，8.64 g生药／kg，剂量为人临床等效剂量，取8.64 g溶入10 mL蒸馏水中；参葵通脉颗粒高剂量组，17.28 g生药／kg，剂量为人临床等效剂量的2倍，取17.28 g溶入10 mL蒸馏水中；空白血清组不给药，给予等量蒸馏水 （上述药物配置的溶剂）灌胃，每天1次，连续14 d。然后，大鼠腹主动脉取血，离心，收集血清，-80℃下保存备用。

2.2 心肌细胞培养 取SD乳大鼠10只，浸入75%乙醇中使其窒息死亡，移入超净台内，2%碘酊、75%酒精消毒皮肤，眼科镊和眼科剪打开胸腔，取出心脏置于平皿中，冰冷缓冲液冲洗3次，剪成1～2 mm3碎块，消化液在37℃下水浴消化8次，每次10 min，前2次消化液中含有较多的血细胞碎屑，弃去，收集后6次消化液，加等体积含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液终止消化，1 000 r／min离心5 min，弃去上清液，加完全培养液将细胞沉淀混匀，制成心肌细胞悬液，移到培养瓶，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中，每天更换培养液1次，待心肌细胞均贴壁生长出伪足连成片状后，即可用于实验。

2.3 分组、建模及给药 将培养好的乳鼠心肌细胞随机分为5组：正常对照组，心肌细胞+空白血清；模型组，心肌细胞+H2O2+空白血清；参葵通脉颗粒低剂量组，心肌细胞+H2O2+低剂量参葵通脉颗粒；参葵通脉颗粒中剂量组：心肌细胞+H2O2+中剂量参葵通脉颗粒；参葵通脉颗粒高剂量组：心肌细胞+H2O2+高剂量参葵通脉颗粒。参考文献 [5-6］， 细胞采用含有 H2O2（100 μmol／L） 的培养液（30%H2O2的浓度大约为 1×107μmol／L， 将其加到 1 mL 完全培养液中，再吸取上述液体10 μmol／L加到10 mL完全培养液中，即得）刺激大鼠原代心肌细胞2 h，造成心肌细胞氧化应激损伤。根据上述分组情况，加入相应的含10%含药血清的培养液，而正常对照组与模型组加入含10%空白血清的培养液，继续培养24 h，采集细胞，养上清液。

2.4 细胞上清液中LDH、CK-MB、MDA水平检测 取细胞培养上清液，按照试剂盒说明书加入试剂，采用分光光度法检测LDH、CK-MB、MDA水平。

2.5 细胞内ATP水平检测 细胞按照试剂盒说明书比例加入裂解液，裂解时用移液枪反复吹打以使裂解液充分接触裂解细胞，4℃、12 000 r／min下离心5 min，取上清，酶标仪检测光密度，BCA蛋白浓度检测试剂盒测定各组蛋白浓度，进而检测细胞内ATP水平。

2.6 p-AMPKα、 AMPKα、 GLUT4、 FAT／CD36、 CPT-1 表达检测 严格按试剂盒操作提取心脏总蛋白，BCA法定量蛋白。采用Western blot法，取蛋白40 g加入缓冲液变性，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜，染色观察条带，TBST洗膜，5%脱脂牛奶 TBST封闭1 h，分别加兔抗大鼠 p-AMPKα、 AMPKα、 GLUT4、 FAT／CD36、CPT-1抗体，室温下孵育2 h，TBST洗膜，加二抗反应1 h，TBST洗膜，ECL发光试剂发光。通过凝胶图像分析软件进行吸光度扫描，计算 p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1蛋白条带的吸光度与β-actin的比值。

2.7 统计学分析 通过SPSS17.0软件进行处理，计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 参葵通脉颗粒对 LDH、CK-MB、MDA水平的影响 表1显示，与正常对照组比较，模型组LDH、CK-MB、MDA水平显著升高 （P＜0.05）；与模型组比较，参葵通脉颗粒组三者水平显著降低 （P＜0.05）。

表1 参葵通脉颗粒对LDH、CK-MB、MDA水平的影响 （ n＝8）

表1 参葵通脉颗粒对LDH、CK-MB、MDA水平的影响 （ n＝8）

注：与正常对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

--组别 LDH／（U·L1） CK-MB／（U·mL1） MDA／（nmol·mL-1）正常对照组 183.63±33.70 0.48±0.13 2.05±0.64模型组 529.87±63.36∗ 1.26±0.41∗ 17.95±2.64∗参葵通脉颗粒低剂量组 399.34±52.98# 0.75±0.38# 9.32±1.52#参葵通脉颗粒中剂量组 329.65±59.41# 0.68±0.29# 7.73±2.33#参葵通脉颗粒高剂量组 306.42±52.02# 0.61±0.27# 6.82±1.37#

3.2 参葵通脉颗粒对ATP水平的影响 表2显示，与正常对照组比较，模型组ATP水平显著降低 （P＜0.05）；与模型组比较，参葵通脉颗粒组 ATP水平显著升高 （P＜0.05）。

表2 参葵通脉颗粒对ATP水平的影响 （ n＝8）

表2 参葵通脉颗粒对ATP水平的影响 （ n＝8）

注：与正常对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 ATP（nmol·mg-1）正常对照组 12.91±1.39模型组 2.76±0.88∗参葵通脉颗粒低剂量组 6.79±1.19#参葵通脉颗粒中剂量组 8.48±1.71#参葵通脉颗粒高剂量组 9.19±2.02#

3.3 参葵通脉颗粒对p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1表达的影响 表3、图1，与正常对照组比较，模型组 p-AMPKα／AMPKα表达显著升高 （P＜0.05），GLUT4、 FAT／CD36、 CPT-1表达显著降低 （P＜0.05）； 与模型组比较，参葵通脉颗粒组四者表达显著升高 （P＜0.05）。

表3 参葵通脉颗粒对p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1表达的影响 （， n＝8）

表3 参葵通脉颗粒对p-AMPKα、AMPKα、GLUT4、FAT／CD36、CPT-1表达的影响 （， n＝8）

注：与正常对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别 p-AMPKα／AMPKα GLUT4／β-actin FAT／CD36／β-actin CPT-1／β-actin正常对照组 0.23±0.05 1.08±0.15 0.47±0.07 0.45±0.08模型组 0.55±0.07∗ 0.41±0.08∗ 0.09±0.04∗ 0.08±0.03∗参葵通脉颗粒低剂量组 1.01±0.12# 0.61±0.06# 0.26±0.04# 0.25±0.04#参葵通脉颗粒中剂量组 1.51±0.16# 0.80±0.06# 0.31±0.08# 0.34±0.05#参葵通脉颗粒高剂量组 1.90±0.13# 0.95±0.15# 0.46±0.08# 0.42±0.04#

图 1 各组 p-AMPKα、 AMPKα、 GLUT4、 FAT／CD36、CPT-1表达

4 讨论

近年来研究表明，心肌能量代谢障碍是慢性心力衰竭的发生机制之一，该疾病发生时心肌氧化应激严重，线粒体损伤，从而导致能量代谢障碍[7］。正常情况下，心肌细胞能利用多种能量底物 （脂肪酸、葡萄糖等），其中脂肪酸供给心脏60%～80%的能量，是主要来源，而发病时脂肪酸代谢受到抑制，糖酵解相对增加[8］。本实验发现，参葵通脉颗粒对氧化应激导致的心肌细胞能量代谢损伤具有良好的改善作用。

参葵通脉颗粒由炙黄芪、灵芝、淫羊藿、桂枝、丹参、黄蜀葵、茯苓、陈皮等组成，方中炙黄芪益气养元，扶正祛邪，养心通脉，健脾利湿，为补气之要药[9］；灵芝补气安神，止咳平喘，延年益寿，用于心神不宁、失眠心悸、肺虚咳喘、虚劳短气、不思饮食[10］，两者共为君药，共奏补心气、安心神之功效；淫羊藿与桂枝共为臣药，前者补肾阳，强筋骨，正合慢性心力衰竭心肾阳虚、失于温运的病机[11］，而后者既可温扶脾阳以助运水，又可温肾阳、逐寒邪以助膀胱气化，而行水湿痰饮之邪[12］，与前者同用时可温阳化气，增强君药补气行血之力；丹参、黄蜀葵、茯苓养血活血利水，共为佐药，发病时心肾阳气亏虚，不能推动血液运行，血脉不利，水饮内停，而丹参功效活血祛瘀、安神宁心，黄蜀葵功效利尿通淋、活血、止血、消肿解毒，茯苓功效渗湿利水、宁心安神，三者合用，有行瘀血而新血不伤、养新血而瘀血不滞之功效；陈皮理气健脾，燥湿化痰，用于发病时水湿困脾之脘腹胀满，并可改善胃肠蠕动，促进诸药吸收，亦为佐药。诸药合用，攻补兼施，扶正不留邪，祛邪不伤正，可促进泵功能恢复。

心肌细胞氧化损伤时，线粒体能量代谢障碍，细胞膜完整性遭到破坏，细胞通透性增加，膜内酶外漏，而测定细胞培养上清液中LDH、CK-MB水平可反映细胞损伤程度。本实验通过H2O2建立心肌细胞损伤模型，发现模型组LDH、CK-MB释放增加，与正常对照组比较有显著差异，表明细胞损伤严重；参葵通脉颗粒能显著抑制两者外漏。MDA是一种脂质过氧化标志物，本实验发现不同剂量参葵通脉颗粒均能显著降低其水平，推测它具有抗自由基和稳定细胞膜的作用。

线粒体氧化应激水平增加时，可使其三磷酸腺苷合成减少[13］，AMPK被认为是细胞的 “油量表”，可检测发现低能量状态，此时磷酸化增加，激活内源性保护蛋白，改善能量代谢[14］。本实验发现，正常对照组p-AMPK表达较低，而受到氧化应激刺激后略有增加；参葵通脉颗粒可促进AMPK磷酸化，改善心肌细胞代谢障碍。

脂肪酸是心肌细胞产生ATP能量的主要底物，CD36是心脏FAT的主要形式，为心脏利用和吸取脂肪酸的主要转位酶[15］；CPT-1是心肌细胞线粒体利用脂肪酸的关键酶，可促进脂肪酸进入线粒体氧化[16］，当心肌细胞发生损伤时，FAT／CD36、CPT-1表达下调，表明脂肪酸代谢障碍。本实验发现，参葵通脉颗粒可促进FAT／CD3、CPT-1，改善脂肪酸代谢障碍。

GLUT4负责细胞内外葡萄糖转移和运送，保护心肌细胞在氧化应激损伤中生存足够的能量[17］。本实验发现，参葵通脉颗粒可促进GLUT4表达，从而提高葡萄糖利用。

综上所述，参葵通脉颗粒对H2O2致乳鼠心肌细胞损伤具有良好保护作用，可促进细胞存活，抑制心肌酶谱分泌，其机制可能与调控糖脂代谢酶、改善心肌细胞能量代谢障碍有关。