五味子中五味子醇甲提取纯化工艺的优化

牟倩倩， 马祖兵， 孙 强， 赵甜甜， 谢 龙， 李 化， 李小芳∗

（1.成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室——省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137；2.中国中医科学院中药研究所，道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700）

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，习称北五味子，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心之功效[1］。现代研究发现，五味子木脂素类成分是五味子主要活性成分，以含有量较高的五味子醇甲为代表，具有镇静、抗惊厥、保护脑神经细胞、保肝等多种药理活性，对肝炎、脑病等有良好的治疗作用[2-6］，2015版 《中国药典》也将其作为该药材质量评价指标成分。目前虽有多篇文献报道了五味子醇甲的提取纯化工艺[7］，但传统方法 （煎煮法、渗漉法、回流法、乙醇沉淀法），普遍存在费时、效率低、样品杂质多等问题；虽新技术 （微波提取法、超临界提取法、高速逆流色谱法等）提高其提取纯化效果，但设备成本较高，操作繁琐，不适合工业化生产。

超声提取法是通过超声波所具有的空化效应、热效应、机械效应来提高溶剂分子运动速度及穿透力，用于提取中药有效成分的一种新技术，以提取温度低、时间短、提取率高的独特优势在中药提取中得到广泛应用。大孔树脂是一种同时具备吸附及筛选功能的高分子聚合物，因其理化性质稳定、不受无机物影响、交换速度快、易解吸、再生处理简单、价格便宜等诸多优点被广泛用于中药活性成分的分离纯化。因此，本实验采用Box-Behnken响应面法优化五味子中五味子醇甲提取纯化工艺，旨在为其他五味子木脂素类成分的提取纯化提供参考，也为相关制剂的开发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪 （日本岛津公司）；KQ-5200DE型数控超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q型超纯水制备仪（美国Millipore公司）；FW80型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；BT125D型电子天平 （德国Sartorius公司）；旋转蒸发仪 （上海爱朗仪器有限公司）；离心机 （德国Eppendorf公司）；THZ-22型恒温摇床 （太仓市实验设备厂）；玻璃层析柱 （内径1.2 cm×40 cm）。

1.2 试药 五味子购于北京同仁堂药房，经中国中医科学院中药研究所李化副研究员鉴定为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.的干燥成熟果实。五味子醇甲对照品购于成都曼斯特生物科技有限公司 （含有量＞99%，批号MUST-15041804）。AB-8、LX-22、X-5等大孔树脂均购于郑州勤实科技有限公司 （批号20160526）。甲醇为色谱纯 （美国Fisher公司）；氢氧化钠、盐酸、无水乙醇等均为分析纯。

2 五味子醇甲提取工艺优化

2.1 含有量测定 参照2015版 《中国药典》五味子项下含有量测定方法[1］，以五味子醇甲含有量为横坐标 （X），峰面积为纵坐标 （Y）进行回归，得到回归方程为Y＝21 468X+8 548.6（R2＝0.999 8）， 在 7.725～92.70 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.2 单因素试验 考察不同乙醇体积分数 （40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）、料液比（1 ∶5、 1 ∶10、 1 ∶20、 1 ∶30、 1 ∶40、 1 ∶50）、超声时间 （5、 10、 20、 30、 40、 50 min）、 超声温度 （20、30、40、50、60、70℃） 对五味子醇甲提取率的影响，重复2次，初始条件设置为料液比1∶40，超声时间20 min，提取温度30℃，超声功率100 W，结果见图1。由图可知，单因素试验中最优提取工艺为乙醇体积分数90%，料液比1∶10，提取时间20 min，提取温度40℃。

2.3 Box-Behnken响应面法 在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数 （A）、提取时间 （B）、提取温度 （C）作为影响因素，五味子醇甲提取率（Y）作为评价指标，设计3因素3水平 （共17组试验，其中12个为析因点，5个为中心点）响应面试验。因素水平见表1，结果见表2。

表1 提取工艺因素水平Tab.1 Factors and levels for extraction technique

图1 各因素对五味子醇甲提取率的影响Fig.1 Effects of various factors on schisandrin extraction rate

表2 提取工艺试验设计及结果Tab.2 Design and results of tests for extraction technique

然后，通过Design Expert软件对表2数据进行拟合，得二次多项回归方程为Y＝0.55-0.016A+0.028B+0.019C-7.5×10-3AB-1.000×10-3AC+2.5×10-3BC-0.013A2-5.5×10-3B2-3.000×10-3C2， 方差分析见表3。由表可知，模型P＜0.01，表明模型显著；失拟项P＞0.05，表明模型拟合度良好；校正决定系数0.923 2，表明92.32%的响应值变化可用该模型来解释；因素A、B、C对五味子醇甲提取率均有极显著影响 （P＜0.01），影响程度依次为 B＞C＞A。

表3 提取工艺方差分析Tab.3 Analysis of variance for extraction technique

响应面分析见图2，可知最优提取工艺为乙醇体积分数81.06%，提取时间13.96 min，提取温度39.61℃，料液比 1∶10，五味子醇甲提取率0.581%，考虑到实际操作的可行性，将其修正为乙醇体积分数81.00%，提取时间14 min，提取温度40℃，料液比1∶10。按上述优化工艺进行5批验证试验，测得五味子醇甲提取率为0.587%，与预测值0.581%相当 （偏差0.71%），表明该工艺准确可靠。

3 五味子醇甲纯化工艺优化

3.1 样品溶液制备 称取五味子干燥粉末适量，按最优提取工艺提取五味子醇甲，合并浓缩提取液，适量去离子水定容，即得，并测定其质量浓度C0。

图2 各因素响应面图 （提取工艺）Fig.2 Response surface plots for various factors（extraction technique）

3.2 树脂型号筛选 精密称取预处理后的7种大孔树脂（ AB-8、 X-5、 D-101、 LX-22、 LX-68、HPD450、LSA-21）各1.0 g，置于125 mL具塞磨口三角瓶中，加入已测定质量浓度的样品溶液30 mL（V1） 于摇床中，在25℃、80 r／min下吸附12 h以达到饱和，减压抽滤，测定滤液中五味子醇甲质量浓度C1。将充分吸附后的大孔树脂用蒸馏水清洗至表面无样品溶液残留，抽滤，置于具塞磨口三角瓶中，加入 95%乙醇 50 mL（V2），25℃下振荡12 h（80 r／min），测定解吸液中五味子醇甲质量浓度C2，计算树脂对该成分的吸附率及解吸率，公式分别为吸附率＝[（C0-C1） V1／C0V1]×100%、解吸率＝[C2V2／（C0-C1）V1］×100%，结果见图3。由图可知，AB-8大孔树脂对五味子醇甲的吸附率和解吸率均最高，与前期报道[8］一致，故选择其进行下一步实验。

图3 大孔树脂吸附率及解吸率Fig.3 Adsorption and desorption rates of macroporous resins

3.3 上样液质量浓度考察 取经预处理的AB-8大孔树脂5 g，湿法上柱，配制0.05、0.1、0.2、0.3、 0.4 g／mL样品溶液， 以 2 mL／min体积流量动态吸附，待上柱样品溶液全部通过树脂柱后收集流出液，测定五味子醇甲质量浓度，计算吸附率，结果见图4。由图可知，随着上样质量浓度增加吸附率先增加后降低，在0.1 g／mL时最高，故确定上样液质量浓度为0.1 g／mL。

图4 上样液质量浓度对吸附率的影响Fig.4 Effect of sample concentration on adsorption rate

3.4 上样液体积流量考察 取经预处理的AB-8大孔树脂5.0 g，湿法上柱，将1.0 g／mL样品溶液以0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0 mL／min体积流量上样吸附，收集过柱残液，测定五味子醇甲质量浓度，计算吸附率，结果见图5。由图可知，上样液体积流量在0.5～1.0 mL／min之间时吸附率变化不大，之后随着其增加而逐渐降低，为缩短纯化周期，故确定上样液体积流量为1.0 mL／min。

图5 上样液体积流量对吸附率的影响Fig.5 Effect of sample volumetric flow rate on adsorption rate

3.5 上样液用量考察 取经预处理的AB-8大孔树脂5.0 g，湿法装柱，将0.1 g／mL样品溶液以1.0 mL／min体积流量连续上样，流出液每20 mL收集1管，测定五味子醇甲质量浓度，绘制泄漏曲线，结果见图6。由图可知，随着上样液用量增加流出液中泄漏的五味子醇甲含有量也随之增加，达到160 mL时该成分明显泄露，达到180 mL时其质量浓度已超过初始的10%，故确定上样液用量为160 mL。

图6 上样液用量对五味子醇甲质量浓度的影响Fig.6 Effect of sample consumption on schisandrin concentration

3.6 洗脱剂体积分数考察 取经预处理的AB-8大孔树脂5.0 g，湿法装柱，将0.1 g／mL样品溶液以1.0 mL／min体积流量上样吸附，先用2 BV去离子水冲洗除杂，再用 30%、50%、70%、80%、95%乙醇各50 mL以1 mL／min体积流量洗脱，收集洗脱液，测定五味子醇甲质量浓度，计算解吸率，结果见图7。由图可知，随着洗脱剂体积分数增加解吸率不断增加，在80%时最高，之后逐渐下降，故确定洗脱剂体积分数为80%。

图7 洗脱剂体积分数对解吸率的影响Fig.7 Effect of eluent concentration on desorption rate

3.7 洗脱剂体积流量考察 取经预处理的AB-8大孔树脂5.0 g，湿法装柱，将0.1 g／mL样品溶液以1.0 mL／min体积流量上样吸附，先用2 BV去离子水冲洗除杂，再用50 mL 80%乙醇以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL／min体积流量洗脱，收集洗脱液，测定五味子醇甲质量浓度，计算解吸率，结果见图8。由图可知，随着洗脱剂体积流量增加解吸率先稍有增加再缓慢下降，在2.0 mL／min时最高，故确定洗脱剂体积流量为2.0 mL／min。

图8 洗脱剂体积流量对解吸率的影响Fig.8 Effect of eluent volumetric flow rate on desorption rate

3.8 洗脱剂用量考察 取经预处理后的AB-8大孔树脂5.0 g，湿法装柱，将0.1 g／mL样品溶液以1.0 mL／min体积流量上样，先用2 BV去离子水洗涤，再用80%乙醇以2.0 mL／min体积流量洗脱，分段收集洗脱液，每份10 mL，测定五味子醇甲质量浓度，绘制洗脱曲线，结果见图9。由图可知，当洗脱剂用量达到50 mL时五味子醇甲基本洗脱完全，为更加充分地洗脱，故确定洗脱剂用量为60 mL。

图9 洗脱剂用量对五味子醇甲质量浓度的影响Fig.9 Effect of eluent consumption on schisandrin concentration

3.9 Box-Behnken响应面法 在单因素试验基础上，选择上样液质量浓度 （A）、洗脱剂体积分数（B）、洗脱剂用量 （C）作为影响因素，五味子醇甲收率 （Y，吸附率×解吸率）作为评价指标，根据Box-Behnken中心试验方案进行3因素3水平设计。因素水平见表4，结果见表5。

表4 纯化工艺因素水平Tab.4 Factors and levels for purification technique

然后，通过Design Expert软件对表5数据进行拟合，得二次多项回归方程为Y＝90.94-4.51A+3.27B+1.63C-0.002 5AB+0.11AC-2.41BC+1.55A2-8.64B2-5.24C2，方差分析见表6。由表可知，模型P＜0.01，表明模型显著；失拟项P＞0.05不显著，表明模型拟合程度良好；校正决定系数0.973 0，表明97.30%的响应值变化可用该模型来解释；因素A、B、C、BC、A2、B2、C2对五味子醇甲收率有显著影响 （P＜0.05），影响程度依次为A＞B＞C。

表5 纯化工艺试验设计及结果Tab.5 Design and results of tests for purification technique

表6 纯化工艺方差分析Tab.6 Analysis of variance for purification technique

响应面分析见图10，可知最优纯化工艺为上样液质量浓度 0.06 g／mL，洗脱剂体积分数84.35%，洗脱剂用量61.98 mL，五味子醇甲收率95.155%，考虑到实际操作可行性，将其修正为上样液质量浓度0.06 g／mL，洗脱剂体积分数85%，洗脱剂用量62 mL。按上述优化工艺进行3批验证试验，测得五味子醇甲收率为94.51%，与预测值95.155%相当 （偏差 0.33%），同时含有量为46.54%，表明该工艺准确可靠。

图10 各因素响应面图 （纯化工艺）Fig.10 Response surface plots for various factors （purification technique）

4 讨论

王磊[9］对五味子醇甲超声提取工艺进行研究，但仅考察了提取溶剂、料液比、超声功率3个因素。本实验在此基础上补充了提取时间、提取温度，使该工艺条件更系统，而且优化所得提取溶剂、料液比及该条件下五味子醇甲提取率与该报道一致，表明该结果准确可靠。李洪洋等[10］对五味子醇甲大孔树脂纯化工艺进行研究，但仅采用单因素试验优化上样液质量浓度等几种参数，而且未测定吸附率、解吸率、收率、含有量等，本实验在单因素试验基础上通过Box-Behnken响应面法考察影响其纯化效果的工艺条件，使实验结果更具体准确。

同时，本研究比较了甲醇和乙醇作为提取溶剂对五味子醇甲提取效果的影响，发现后者效果稍优，同时考虑到工业生产中它相对更加安全、便宜，故选择乙醇作为提取溶剂。