GDF15和MMP7的表达与胃癌临床病理特征及其预后的相关性

郭小刚,李 东,黄自铎

(重庆市黔江中心医院普外科,重庆 409000;*通讯作者,E-mail:limao1816@sina.com)

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,我国胃癌死亡率占全部恶性肿瘤的23.2%,位于恶性肿瘤死亡率的第一位[1,2]。MMP7又称基质溶解素(matrilysin),基因定位于11号染色体q21-q22上,编码267个氨基酸,是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族成员之一[3]。MMP7蛋白有基质降解活性和底物特异性,能够特异性降解细胞外基质和基底膜成分,对细胞生长、分化和凋亡等具有调控作用[4]。MMP7过表达加速胃癌细胞的浸润和转移[5]。生长分化因子15(growth differentiation factor 15,GDF15),又称前列腺衍生因子(prostate-derived factor,PDF),是转化生长因子(transforming growth factor,TGF-β)超家族成员,基因定位于19号染色体p13.11上[6]。已经有研究报道GDF15和MMP7可能参与胃癌的发生发展[7],但是关于GDF15、MMP7和胃癌预后的相关性研究仍鲜有报道。本研究即分析GDF15和MMP7蛋白表达与胃癌临床病理特征及胃癌患者术后预后的相关性,为探索新的胃癌预后指标以及开发高效的靶向治疗药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

研究所需样本组织收集自重庆市黔江中心医院2014-06～2016-03胃癌术后标本作为研究材料,共106例,其中女性胃癌患者61例,男性胃癌患者45例;平均年龄(58.65±12.57)岁;肿瘤直径<4 cm 34例,肿块≥4 cm 72例;有淋巴结转移64例,无淋巴结转移42例;TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期48例,Ⅲ、Ⅳ期58例。所有患者术前均未接受化、放疗。本研究经过重庆市黔江中心医院伦理委员会审核批准,获得所有受试者或者其家属的书面同意书。

1.2 主要试剂和仪器

1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

1.4 Western blot检测胃癌组织和癌旁组织GDF15和MMP7蛋白表达

样本研磨后,加蛋白裂解液,置冰上30 min,离心取上清液,测定蛋白浓度,垂直电泳,室温下孵育二抗1 h,TBST洗膜3次,每次15 min。ECL显色3-5 min,在暗室显影。

1.5 免疫组织化学染色检测胃癌组织和癌旁组织GDF15和MMP7蛋白表达

用4%福尔马林对肿瘤样本和对照组织进行固定,然后进行石蜡包埋,在石蜡切片机进行切片,厚度为5 μm。脱蜡后进行免疫组织化学染色。简要步骤如下:100 ℃条件下抗原修复5 min,PBS洗3次。加10%羊血清室温封闭30 min。放在摇床上,4 ℃条件下过夜孵育一抗。37 ℃条件下孵育辣根过氧化物酶标记的二抗30 min,室温下PBS洗3次,每次5 min,双蒸水洗一次。滴加事先配好的DAB显色液,光镜下观察显色程度。苏木素复染后脱水,中性树胶封片晾干后观察拍照。

1.6 免疫组化结果判定标准

细胞染色强度评分标准:无显色为0分,呈浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。阳性细胞数评分标准:阳性细胞占总细胞数的0%-10%设为0分,10%-50%设为1分,50%-80%设为2分,80%-100%设为3分。染色强度评分和阳性细胞数评分的乘积≥3者为阳性,<3者则为阴性。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计分析,计数资料采用χ2检验,计量资料组间差异采用t检验,采用Kaplan-Meier进行单因素生存分析。当P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GDF15 mRNA和MMP7 mRNA在胃癌组织和癌旁组织中的表达

qRT-PCR实验结果显示,与癌旁正常胃组织相比,胃癌组织中GDF15 mRNA和MMP7 mRNA表达水平均升高(见图1)。

2.2 GDF15蛋白和MMP7蛋白在胃癌组织与癌旁组织中的表达

Western blot实验结果显示,与癌旁正常胃组织相比,胃癌组织中GDF15蛋白和MMP7蛋白表达量均增多(见图2)。对免疫组织化学结果进行量化分析,GDF15在胃癌组织中的阳性表达率为73.58%,明显高于癌旁正常胃组织表达率(26.32%),差异有统计学意义(χ2=44.80,P=0.000 1,见图3,表1)。胃癌组织中MMP7表达阳性率为78.30%,明显高于癌旁正常胃组织表达率(46.32%),差异有统计学意义(χ2=22.03,P=0.000 1,见图3,表1)。

2.3 胃癌组织中GDF15蛋白和MMP7蛋白的表达与相关临床参数的关系

GDF15蛋白与肿瘤直径有关(χ2=5.527,P=0.019),与年龄、性别、淋巴结转移和TNM分期无关。MMP7蛋白和淋巴结转移(χ2=8.043,P=0.005)和TNM分期(χ2=9.717,P=0.002)有关系,与年龄、性别和肿瘤直径无关(P>0.05,见表2)。

2.4 胃癌组织中GDF15和MMP7蛋白表达与胃癌患者预后相关性

Kaplan-Meier生存曲线分析显示,GDF15阴性胃癌患者生存率比GDF15阳性胃癌患者更高(χ2=6.531,P<0.01,见图4A),MMP7阴性胃癌患者生存率大于阳性胃癌患者(χ2=4.278,P<0.05,见图4B)。

与癌旁组织比较,*P<0.05,**P<0.01图1 GDF15 mRNA和MMP7 mRNA在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平Figure 1 The expression levels of GDF15 mRNA and MMP7 mRNA in gastric carcinoma tissues and paired adjacent tissues

与癌旁组织比较,*P<0.05,**P<0.01图2 Western blot检测GDF15蛋白和MMP7蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平Figure 2 The expression levels of GDF15 protein and MMP7 protein in gastric carcinoma tissues and paired adjacent tissues byWestern blot

图3 GDF15蛋白和MMP7蛋白在胃癌组织和癌旁组织中表达的SP染色 (×200)Figure 3 The expression levels of GDF15 protein and MMP7 protein in gastric carcinoma tissues and paired adjacent tissues by SP (×200)

表1GDF15和MMP7在胃癌和癌旁正常组织阳性表达率的比较例(%)

Table1ComparisonofpositiveexpressionrateofGDF15andMMP7betweengastriccancertissueandnormaltissueadjacenttocarcinomacases(%)

组别nGDF15MMP7阴性阳性χ2P阴性阳性χ2P 胃癌组织10628(26.42)78(73.58)5.8040.00023(21.70)83(78.30)5.0530.000 癌旁组织9570(73.68)25(26.32)51(53.68)44(46.32)

3 讨论

胃癌是死亡率非常高的恶性肿瘤,术后复发以及化疗副作用使胃癌患者预后较差,尤其是晚期胃癌患者平均生存期还不到一年[8]。因此,研究胃癌发病的具体分子机制,鉴定胃癌早期诊断和理想的预后标志物,筛选高效药物治疗靶点,对提高胃癌患者的生存率有重要意义。生长分化因子15(growth differentiation factor-15,GDF15)作为转化生长因子-β超家族中的一员,在人体组织中广泛表达。GDF15可被多种因素诱导表达,通过SMAD通路和非SMAD通路发挥作用[9]。在不同微环境下,GDF15对于血管生成有关键作用。GDF15与基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP7)对肿瘤血管生成均有调控作用[10],故选择这两个分子进行研究。

表2胃癌组织中GDF15和MMP7的表达与相关临床病理参数的关系例(%)

Table2AssociationbetweentheexpressionofGDF15andMMP7ingastriccarcinomatissuesandclinicopathologicalparameterscases(%)

病理参数nGDF15MMP7阴性阳性χ2P阴性阳性χ2P年龄 0.10170.7500.5650.452 <60岁3911(28.21)28(71.79)10(25.64)29(74.36) ≥60岁6717(25.37)50(74.63)13(19.40)54(80.60)性别1.925 0.1650.1330.716 男4515(33.33)30(66.67)9(0.20)36(0.80) 女6113(21.31)48(78.69)14(22.95)47(77.05)肿瘤直径5.527 0.0193.3450.067 <4 cm34 4(11.76)30(88.24)11(32.35)23(67.65) ≥4 cm7224(33.33)48(66.67)12(16.67)60(83.33)淋巴结转移0.509 0.4768.0430.005 有6421(32.81)43(67.19) 8(12.50)56(87.50) 无4227(64.29)15(35.71)15(35.71)27(64.29)TNM分期0.090 0.7649.7170.002 Ⅰ、Ⅱ期4812(0.25) 36(0.75) 17(35.42)31(64.58) Ⅲ、Ⅳ期5816(27.59)42(72.41) 6(10.34)52(89.66)

图4 胃癌组织中GDF15和MMP7蛋白表达与患者总生存期的关系Figure 4 Relationship between the expression of GDF15 and MMP7 in gastric carcinoma tissues and overall survival of gastric cancer patients

GDF15被发现在多种癌症的肿瘤组织中高表达,转录生长因子受体2介导的信号途径能够调控GDF-15的表达。在直肠癌的研究中,发现GDF15通过绑定TGF-β受体激活Smad2和Smad3信号途径,促进上皮间质转化和肿瘤转移。胃癌患者血浆和血清中GDF15水平比健康对照明显升高,并且血浆中升高的GDF15水平与胃癌病人较差的预后相关[11,12]。Ishige等[13]研究发现,GDF15在胃癌组织高表达,胃癌患者血清GDF15水平显著高于健康对照和胃炎患者,并与壁浸润和淋巴结转移呈正相关。GDF15还能促进成纤维母细胞激活。GDF15蛋白在胃癌组织的表达以及与胃癌患者预后的相关性仍不明确。与既往报道结果一样,本研究发现胃癌组织GDF15 mRNA和蛋白表达水平比癌旁正常组织明显升高,GDF15在胃癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁正常胃组织。重要的是,本次研究最新发现,GDF15蛋白阳性表达与肿瘤直径大小相关,GDF15阴性胃癌患者生存率比GDF15阳性胃癌患者更高。

既往研究表明,胃癌的侵袭和转移与肿瘤细胞迁徙、黏附关系紧密,并且细胞外基质降解、肿瘤血管生成在胃癌的侵袭、转移过程具有重要作用[14,15]。肿瘤细胞浸润和转移的关键是穿透宿主组织,该过程涉及到细胞外基质的破坏。在胃癌细胞,MMP7能够特异性降解肿瘤细胞外生理与病理性基质的降解和基底膜成分,从而促进胃癌的侵袭和转移[16]。Sentani等[17]发现,胃癌组织中MMP7蛋白的表达水平明显高于癌旁正常组织,并且MMP7强阳性的胃癌患者表现出较强的浸润胃壁及淋巴管、血管渗透能力。异柠檬酸脱氢酶2(isocitrate dehydrogenase 2)通过核转录因子NF-κB(nuclear factor κB)信号途径抑制MMP7表达,从而抑制胃癌细胞的侵袭能力[18]。研究证明,抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号通路后,MMP7蛋白表达下调,胃癌转移能力下降[19]。MMP7是Wnt/β-cat信号通路的下游靶基因,受Wnt/β-catenin信号通路调控的MMP7进一步参与到基底膜和细胞外基质分解过程,最终造成肿瘤侵袭、转移[20]。本研究显示,胃癌组织中MMP7蛋白高表达,并且与胃癌淋巴结转移和TNM分期相关,说明MMP7和胃癌侵袭性具有直接关系。重要的是,Kaplan-Meier生存曲线分析显示,MMP7阴性胃癌患者生存率大于阳性胃癌患者。

综上所述,GDF15和MMP7是影响胃癌患者术后生存的危险因素,可以作为评估胃癌患者预后良好与否的参考指标。GDF15和MMP7可能成为新的胃癌治疗靶点。