哈尔滨地区产ESBLs鲍曼不动杆菌流行病学和耐药基因研究*

高春波，苏丽菊，柴 淼，张 萌，郑力辉

(哈尔滨市第一医院检验科，黑龙江哈尔滨 150010)

鲍曼不动杆菌是引起院内感染的重要条件致病菌[1],可导致呼吸道感染、败血症、泌尿系感染、脑膜炎、腹膜炎等[2-5]。近年来，随着抗菌药物的广泛应用和不合理使用，鲍曼不动杆菌对几乎各类化学结构的临床常用抗菌药物呈现高度的天然固有耐药性和获得性耐药性，多重耐药的鲍曼不动杆菌已成为医院感染的重要病原菌[6]。鲍曼不动杆菌耐药机制非常复杂，其中产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是主要耐药机制之一[7]。产ESBLs可导致对青霉素类、1～3代头孢菌素、单环酰胺类药物耐药，部分还可水解第4代头孢菌素，给临床抗感染治疗带来了严峻挑战[8]。因此，本研究探讨哈尔滨地区的产ESBLs鲍曼不动杆菌流行情况及基因型，旨在控制其传播并为该类抗菌药物的合理使用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 收集2017年4-7月哈尔滨地区2家综合性三甲医院(哈尔滨市第一医院和哈尔滨医科大学附属第四医院)临床分离的鲍曼不动杆菌共190株。标本来自血液、痰液、肺泡灌洗液、分泌物等，剔除同一患者同一部位重复分离菌株。采用VITEK-2细菌鉴定分析仪进行鉴定。

1.1.2主要试剂 药敏纸片：氨苄西林/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、环丙沙星、亚胺培南、美罗培南、米诺环素、替加环素、复方磺胺甲噁唑、庆大霉素均购自英国Oxiod公司。血琼脂培养基、MH培养基均购自郑州安图生物有限公司，聚合酶链反应(PCR)试剂盒购自Takara大连宝生物工程有限公司，引物由上海生物工程公司合成。脉冲场级琼脂糖购自美国Bio-Rad 公司，溴乙锭购自上海Sangon公司，PMSF购自Merk 公司。

1.2方法

1.2.1药敏试验及ESBLs菌株筛选 采用K-B纸片扩散法测定鲍曼不动杆菌对以上14种抗菌药物的敏感性及进行ESBLs菌株筛选。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853，购自国家卫生健康委员会临床检验中心。结果参照美国临床实验室标准化委员会(CLSL)2017年版标准进行判读。

1.2.2基因检测 采用PCR法扩增主要的ESBLs编码基因，包括PER-1、SHV-1、TEM-1、VEB、CTX-M、OXA-23基因型。引物设计参考文献报道[9]，反应总体积为25.0 μL，包括0.2 μL Taq酶5 U/μL，含MgCl2的2.5 μL 10×缓冲液，2.5 μL dNTP，上下游引物各1.0 μL，3.0 μL DNA模板，14.8 μL ddH2O。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳。PCR产物测序由上海生工有限公司完成。测序结果在Gen Bank网上进行序列比对。

1.2.3脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性

1.2.3.1制备染色体DNA 将菌株配至4 麦氏浓度菌悬液，取2 mL 菌悬液12 000 r/min离心2 min，弃上清，取300 μL 细菌悬浊液于1.5 mL eppendorf管中，平衡至50 ℃;加入50 ℃等体积2% Clean-cut 琼脂糖凝胶，充分混匀并迅速灌注模具，4 ℃冰箱中凝固20 min。将胶块置于离心管中，加入溶菌酶液，37 ℃水浴箱孵育2 h，吸出溶菌酶液，无菌水清洗胶块2次，然后加入蛋白酶K液(终浓度0.8 mg/mL)，50 ℃水浴箱中孵育24 h。清洗胶块，吸掉蛋白酶K液，加1×TE缓冲液1 mL，室温下轻轻振荡30 min。吸出清洗液，加入1 mL酶终止液(PMSF，浓度为1 mmol/L)灭活剩余的蛋白酶K，室温下轻轻振荡30 min。再加TE液重复清洗3次，每次30 min，4 ℃保存备用。

1.2.3.2细菌DNA限制性酶切 加入40 U限制性内切酶Apa Ⅰ、10×内切酶切缓冲液、0.1%牛血清白蛋白(BSA)12 μL，加入去离子水至120 mL，37 ℃水浴箱中孵育过夜。

1.2.3.3加样和电泳 用0.5×TBE缓冲液配制1%的PFGE级琼脂糖胶，在电泳槽中加入2 L TBE缓冲液，将消化好的细菌胶块小心放入梳孔中，在空隙处加入融化的琼脂糖凝胶进行密封。电泳条件为14 ℃,电场强度6 V/cm,脉冲角120度，脉冲时间15 s,电泳时间20 h。电泳结束后，用0.25 mg/L的EB染色液染色30 min，蒸馏水清洗30 min，最后对结果进行图像采集。

1.2.3.4PFGE结果判定 PFGE分子分型依据美国疾病控制和预防中心(CDC)TENOVER等[9]推荐的方法判读。图谱完全相同的定义为一个型，彼此之间相差一个带的定为同一型的不同亚型，相差2～3个带的认为亲缘关系密切，相差4～6个带的认为可能相关，条带相差7个及以上的认为无亲缘关系。并随机选择不同的字母如A、B、C、D等的字母顺序分型。

1.3统计学处理 采用WHONET5.6软件统计，应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数和率表示，组间率的比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1鲍曼不动杆菌的耐药性分析 190株鲍曼不动杆菌中，对米诺环素、替加环素、头孢哌酮/舒巴坦敏感率最高，分别为95.3%、93.2%、56.8%。耐药率高于70.0%的抗菌药物为头孢他啶和派拉西林，其余药物耐药率均高于50.0%。见表1。

表1 190株鲍曼不动杆菌对14种抗菌药的药敏结果(%)

2.2产ESBLs鲍曼不动杆菌的基因型 190株鲍曼不动杆菌中筛选出产ESBLs菌株共58株，检出率为30.5%，PCR分析结果显示PER-1基因型26株，TEM-1基因型23株，SHV-1基因型1株，OXA-23基因型24株，其中37.0%同时携带PER-1、TEM-1、OXA-23这3种基因型。其余基因型检测结果为阴性。

2.3PFGE同源性分析 通过分析PFGE电泳图谱，58株产ESBLs鲍曼不动杆菌主要分为5型，分别用A、B、C、D、E表示，来自哈尔滨市第一医院的39株产ESBLs鲍曼不动杆菌菌株分为A、B、C型，以A型为主，为35株，其中A1亚型有27株，A2亚型有5株，A3亚型有3株；B型有3株；C型有1株。哈尔滨医科大学附属第四医院的19株产ESBLs鲍曼不动杆菌中，5株与哈尔滨市第一医院A1条带一致；12株为D型，其中D1亚型9株，D2亚型3株；2株为E型。

3 讨 论

鲍曼不动杆菌为非发酵革兰阴性杆菌，该菌在医院的环境中分布很广且可长期存活，对危重患者威胁很大，可引起全身系统各个器官的感染，是引起院内感染高发病率和病死率的重要原因[10]。近年来，由于抗菌药物的广泛应用和抗菌药物的滥用，多重耐药性鲍曼不动杆菌日益严峻，尤其是ESBLs介导的β-内酰胺类抗菌药物耐药，给临床治疗带来极大困难[11]。本研究中，在分离的190株鲍曼不动杆菌中，对米诺环素、替加环素、头孢哌酮/舒巴坦敏感率最高，分别为95.3%、93.2%、56.8%。耐药率高于70.0%的抗菌药物为头孢他啶和派拉西林，其余药物耐药率均高于50.0%，耐药情况比较严重。

近年来，鲍曼不动杆菌院内感染和耐药性已成为全球性防治难题[12]。研究表明，随着广谱β-内酰胺类抗菌药物在临床的广泛应用和抗菌药物使用模式的不同，近年来，又出现了许多新的β-内酰胺类耐药基因型，且因地域不同，特点也不尽相同[13-15]。本研究发现，本地区鲍曼不动杆菌中ESBLs基因检出率为30.5%(58株)，其中，以PER-1基因型为主，检出26株，证实PER-1型在本地区为流行株。37.0%同时携带PER、TEM、OXA-23 基因型。

PFGE技术是近年来发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA的电泳技术[16]。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子(>10 kb)移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带，PFGE的发明正好解决了这一难题，它可以用来分离大小从10 kb到10 Mb的DNA分子，具有高分辨力、重复性好的优点，使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生物基因组结构的研究，并被誉为细菌分子学分型技术的“金标准”[17]。 本研究采用PFGE技术对本地区产ESBLs鲍曼不动杆菌进行流行病学分析。通过分析PFGE电泳图谱，58株产ESBLs鲍曼不动杆菌主要分为5个克隆株，A1型为主要克隆株，在医院内、医院间传播，成为本地区鲍曼不动杆菌不断增加，耐药率不断上升的原因。因此，加强对鲍曼不动杆菌耐药监测，及时发现和隔离，规范抗菌药物的使用和管理，做好院内感染，有效预防和控制本地区耐药菌株的产生及传播，具有很重要的意义和价值。

综上所述，哈尔滨地区鲍曼不动杆菌耐药情况严重。鲍曼不动杆菌菌株产ESBLs酶是耐β-内酰胺类抗菌药物的主要原因。产ESBLs鲍曼不动杆菌以PER-1基因型为主，本地区鲍曼不动杆菌流行株存在医院之间交叉感染现象。