间皮素在卵巢癌肿瘤微环境中作用的研究

王路遥，蒋晶，岳欣，陆皓，霍利婷，王昊，王蓓蒂，GC GOMA，李佩玲

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中较为常见的一种，病死率居女性生殖系统恶性肿瘤之首，严重威胁女性健康和生命。由于大多数患者就诊时已为晚期并且出现广泛的腹腔内转移，卵巢癌患者5年生存率不足30%。但在发生转移前诊断的卵巢癌患者，5年总生存率可超过90%[1]。可见提高卵巢癌的早期诊断率对治疗和预后至关重要，而卵巢癌的早期症状和体征常呈非特异性而不易被早期发现。约90%的卵巢癌为上皮性卵巢癌（epithelial ovarian carcinoma，EOC），其中高级别浆液性癌（high-grade serous carcinoma，HGSC）占70%。50%～80%的HGSC患者在肿瘤进展的所有阶段都存在p53突变。50%～70%有卵巢癌家族史的患者存在肿瘤抑制基因乳腺癌易感基因1（BRCA1）和BRCA2的突变。

由于卵巢癌复杂的重叠信号网络，以及由间皮细胞、内皮下基质和脂肪组成的腹膜肿瘤微环境，该病至今仍缺乏根治方法，其主要死亡原因是难以控制腹腔内转移。与其他癌症不同，卵巢癌特有的转移方式是种植性转移，即原发（卵巢/输卵管）肿瘤的肿瘤细胞（单细胞或多细胞聚集体）脱落种植于其他部位，有别于传统研究的血行转移。肿瘤细胞在脱落之前经历上皮-间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），导致E钙黏蛋白（位于细胞连接处的糖蛋白）的丢失和侵袭性表型的产生，增加了卵巢癌细胞的扩散和侵袭能力。转移的肿瘤细胞由于体液流动而遍布腹腔，首先附着于覆盖腹腔所有器官的间皮，包括网膜、腹膜和对侧卵巢。播散的肿瘤细胞在网膜上的增殖最终导致胃肠梗阻等临床症状[2]。

目前尚无有效的早期筛查卵巢癌的方法。现有的诊断方法包括妇科检查、经阴道超声检查和CA125的血清学测定。间皮素（mesothelin，MSLN）是1992年由Chang等[3]首次发现的一种在间皮细胞中表达并在EOC中过表达的糖蛋白，其可以作为新的肿瘤标志物和治疗靶点。了解肿瘤和间皮素的相互作用以及肿瘤转移微环境的分子机制对未来卵巢癌的治疗具有重要意义。

1 CA125

CA125是1981年由Bast等[4]在用人卵巢癌细胞免疫的小鼠产生的单克隆抗体OC125中发现的一种高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，是黏蛋白16（MUC16）的重复肽表位，也是一种膜结合细胞表面黏蛋白，属于包含O连接寡糖和N连接寡糖的黏蛋白家族。因为CA125在正常卵巢组织中低表达，而在卵巢癌中高表达，故其诊断的敏感度较高，但特异度较差。80%的EOC患者血清CA125升高，但近半数的早期病例并不升高，故血清CA125不单独用于EOC的早期诊断。90%卵巢癌患者血清CA125与病程进展有关，通常用作监测疾病进展和复发的标志物。CA125/MUC16可抑制卵巢癌自然杀伤细胞的细胞溶解反应，可抑制针对卵巢癌细胞的免疫应答[5]。尽管主流研究关注的是CA125在卵巢癌中的作用，但是Streppel等[6]的研究表明CA125在如腹膜间皮瘤、胰腺癌、结肠癌中也高表达，表明CA125与间皮细胞也存在相互作用。

2 间皮细胞

腹腔的所有器官都由间皮覆盖。间皮是由纤维连接蛋白、胶原Ⅰ、胶原Ⅳ和层黏连蛋白组成的基底膜覆盖单层间皮细胞构成的。间皮细胞是来自中胚层的扁平鳞状细胞，具有上皮和间质双重特性。其具有发达的细胞-细胞连接复合性（包括紧密连接），这对于细胞表面极性和半渗透性扩散屏障的形成和维持至关重要。间皮的功能是为器官和组织的自由运动提供保护屏障以及无摩擦的界面。间皮在促进腹膜腔内环境稳定、液体和细胞运输、组织修复、炎症的发生和结束以及肿瘤扩散等方面发挥着重要作用。在肿瘤微环境中，癌细胞分泌体预处理间皮细胞以诱导多种促炎因子的表达。间皮细胞参与EMT和间皮-间质转化（mesothelial-to-mesenchymal transition，MMT，EMT样过程）。EMT是上皮细胞失去细胞-细胞黏附并获得迁移特性的生物学过程，MMT是腹腔间皮细胞获得成纤维细胞样表型、转移能力增加的生物过程。腹膜和腹腔器官存在表达MSLN的间皮细胞，使脱落的卵巢癌细胞易发生黏附和转移。

3 MSLN

人MSLN基因位于染色体16p13.3上，长度约为8 kb，由16个长度为7 733 bp的外显子组成。在异常过表达MSLN的癌细胞中，18 bp的增强子序列CanScript位于MSLN基因的启动子区的3个转录起始位点的5′端-65～-46 bp区间。CanScript由2个功能上假定结合的基序组成：传统的MCAT元件和SP1样元件。MCAT元件中的8个核苷酸都显示出其功能的必要性。而SP1样元件存在2个突变，表明MSLN的癌症特异性表达是通过与未知转录因子结合发生的。但已研究的转录因子[如Kruppel样因子6（KLF6）和 Yes相关蛋白 1（YAP1）]不足以证明某些癌症的MSLN过表达，因而在人类癌症中调节MSLN过表达的基本转录因子尚未确定[7]。

MSLN的前体蛋白是长约70 ku的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的膜糖蛋白，可以在精氨酸295（Arg295）处被蛋白水解酶水解成两部分，分别为30 ku的巨核细胞增强因子（megakaryocyte potentiating factor，MPF）和40 ku的具有细胞黏附性的MSLN膜结合片段。尽管许多预测程序试图预测前体MSLN和成熟MSLN的三维结构，但该结构目前仍然未知。Hellstrom等[8]研究发现MSLN主要表达于胸膜、心包膜和腹膜的间皮细胞表面，并能释放到多种肿瘤患者的体液中。MSLN在正常的间皮细胞中微量表达，而在70%的卵巢癌、间皮瘤和胰腺癌中高表达，因此可以作为相关的肿瘤标志物[9]。敲除MSLN基因的小鼠不呈现异常表型，表明MSLN是非必需蛋白，故其生物学功能尚不完全清楚。目前已知MSLN通过丝裂原活化蛋白激酶/胞外信号调节蛋白激酶（MAPK/ERK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路诱导耐药，从而增加卵巢癌的侵袭性，显示出致癌特性，在细胞黏附、肿瘤演进和化疗耐药中均发挥作用。

4 MSLN和CA125

CA125是MSLN的配体，二者共同介导细胞黏附。Rump等[10]证实MSLN与CA125相互结合成为MSLN:CA125复合体，介导人卵巢癌细胞系（OVCAR3）的异型细胞黏附。Gubbels等[11]研究发现MSLN以一种特定的N连接糖依赖途径与CA125结合，因此表达CA125的卵巢癌细胞可以特异性地与表达MSLN的腹膜间皮相结合。因此，MSLN:CA125复合体介导的细胞黏附在卵巢癌细胞腹膜种植中可能起到重要作用[12]。卵巢癌细胞附着于腹膜间皮后，MSLN和CA125的共同过表达可导致更多卵巢癌细胞从原发部位脱落。因此，转移病灶可能是腹水循环中单细胞或多细胞聚集体的过度增殖和黏附的结果。MSLN在肿瘤进展中的确切功能尚不清楚，但研究MSLN与CA125结合发挥的作用可以为寻求抑制卵巢癌转移的新疗法提供思路。

5 MSLN作为肿瘤标志物的应用

阐明MSLN的功能有助于卵巢癌的早期发现，化疗效果的提高，预后的改善和新靶向治疗方法的研究[13]。首先，MSLN良好的内化作用使其成为良好的免疫毒素靶点。其次，MSLN可以从细胞表面快速脱落，此过程由卸离酶和肿瘤坏死因子α（TNF-α）转化酶（TACE）介导。TACE是一种跨膜糖蛋白，可以调节表皮生长因子受体（EGFR）途径的激活，因其从细胞表面释放EGFR配体而得名。脱落的MSLN在腹水或血液循环中产生大量抗原，因此可定量测定循环血清的MSLN水平用于早期诊断卵巢癌。研究组发现卵巢癌患者手术治疗后血清MSLN水平下降，说明MSLN可以用于监测卵巢癌的治疗效果[14]。

6 分子影像学在MSLN检测中的应用

MSLN可以作为分子成像探针的检测靶点评估卵巢癌的治疗效果，检测原发肿瘤和转移病灶的分布[15]。Prantner等[16]研究了抗 MSLN 纳米抗体（NbG3a）的特性，NbG3a对MSLN具有高亲和力和特异性，可用于常规或基于纳米技术的疾病诊断、治疗和预后。该研究表明NbG3a作为新型分子成像探针的可能性，及其在人体成像和治疗应用中的无限前景。抗体-药物偶联物（ADC）利用单克隆抗体作为载体，可选择性地向靶向肿瘤细胞递送有效的细胞毒药物，而对标记的单克隆抗体进行分子成像则有助于预测ADC疗效。Terwisscha van Scheltinga等[17]研究发现，用锆89（89Zr）标记的单克隆抗MSLN抗体联合免疫正电子发射计算机断层扫描（PET）法进行分子成像，可以测定其ADC（抗MSLN抗体－单甲基抗体Auristain E）抑制肿瘤生长的功效。此外，Sirois等[18]研究发现非抗体蛋白支架能高度特异性结合MSLN，且其具有体积小、可快速清除的优点，可用于识别小鼠模型中表达MSLN的肿瘤细胞，在临床前和临床评价中都取得了良好的效果。

7 临床试验

7.1 免疫毒素SS1P的临床试验免疫毒素是目前在恶性肿瘤临床试验中研发的新型抗体结合治疗剂，由抗体靶向结构域与细菌毒素融合而成，用于细胞杀伤[19]。Alewine等[20]设计了一种MSLN靶向免疫毒素SS1P，其由抗MSLN抗体的Fv部分与假单胞菌外毒素A（PE38）的截短部分组成而成。SS1P的细胞杀伤机制分为3个步骤：①SS1P与细胞表面的MSLN结合；②SS1P通过MSLN介导的内化过程进入细胞，其假单胞菌外毒素A（pseudomonas exotoxin A）部分易位至胞质；③PE分子引起延伸因子2（EF-2）的二磷酸腺苷（ADP）核糖基化，导致蛋白质合成和凋亡的停滞。研究表明SS1P对间皮瘤细胞毒性很大，尽管正常组织中MSLN表达水平低，但患者对其耐受性良好，Ⅰ期临床试验中患者不良反应较少。Kreitman等[21]和Hassan等[22]进行的Ⅰ期临床试验研究了间皮瘤、卵巢癌和胰腺癌患者连续输注（continuous infusion）SS1P或大剂量静脉输注（bolus i.v.infusion）SS1P的2种不同给药模式的临床效果，均表现出良好的耐受性和适度的临床活性，其结果支持SS1P临床治疗，但SS1P的治疗效果还需Ⅱ期临床试验继续评估。

7.2 抗MSLN嵌合单克隆抗体的临床试验MORAb-009是一种抗MSLN嵌合单克隆抗体[23]。Hassan等[24-25]进行了Ⅰ期临床试验确定其安全性，剂量限制性毒性（DLT）和最大耐受剂量（MTD）。应用MORAb-009治疗的间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌患者的血清CA125水平显著增加（包括治疗前CA125未升高的患者）。此种情况不是由于疾病进展，因为在停止MORAb-009治疗后CA125水平迅速下降。其原因可能是MORAb-009能够抑制肿瘤脱落的CA125与存在于腹壁和腹膜腔的间皮细胞上的MSLN的结合。此研究表明抑制MSLN:CA125相互作用可能是预防间皮瘤和卵巢癌中肿瘤转移的有用方法。

7.3 肿瘤疫苗的临床试验在Le等[26]进行的Ⅰ期临床试验中，活减毒斯特菌（Lm）菌株经工程改造后可成为表达人MSLN的肿瘤疫苗CRS-207。CRS-207可诱导特异性T细胞对表达MSLN的鼠肿瘤产生免疫反应，并且人体对其具有良好的耐受性，不良反应较少。该研究不仅证明了疫苗的安全性和耐受性，而且表明经肿瘤抗原修饰的Lm疫苗可诱导晚期癌症患者的肿瘤抗原特异性T细胞反应，提示MSLN可作为潜在肿瘤治疗靶点，改善肿瘤治疗的临床效果。

7.4 新型MSLN靶向ADC的临床试验Anetumab ravtansine（BAY94-9343）是一种新型MSLN靶向ADC，其由人抗MSLN抗体与微管蛋白抑制剂DM4连接而成[27]。Golfier等[28]进行的Ⅰ期临床试验研究BAY94-9343对晚期实体瘤（包括卵巢癌和间皮瘤）患者的安全性和最大耐受剂量。Ⅰb期临床试验中，聚乙二醇化脂质体阿霉素和BAY94-9343联合应用，用于治疗表达MSLN的铂耐药性复发性卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌，以研究BAY94-9343的最大耐受剂量。研究证实BAY 94-9343在体外对MSLN阳性细胞具有选择性细胞毒性，且不影响MSLN阴性或非增殖细胞；在体内能够高效结合人MSLN以诱导抗原内化作用，特异性地定位于MSLN阳性肿瘤细胞并且在皮下和原位种植转移模型中抑制肿瘤生长。研究表明BAY 94-9343的抗肿瘤功效与MSLN的表达量相关，可开发用于治疗表达MSLN的肿瘤患者。

8 结语

卵巢癌是女性患者中最致命的妇科恶性肿瘤，发现时常已为晚期伴有广泛腹腔转移。MSLN是一种在间皮细胞中正常表达，而在卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤等疾病中高度表达的糖蛋白，这使其成为靶向治疗的新热点，针对MSLN的免疫疗法正在进行临床试验。MSLN:CA125复合体介导的细胞黏附在卵巢癌细胞腹膜种植中可能起重要作用，而干扰MSLN:CA125结合的新方法正在研究进行中。虽然MSLN与许多癌症有关，但其确切的作用仍不清楚，值得进一步研究和临床试验研究。MSLN在肿瘤转移中的潜在作用需要进一步的机制研究，这可能为几种癌症的有效的MSLN靶向治疗提供新思路。