晚期糖基化终产物对体外培养人腹膜间皮细胞上皮-间叶转化的影响

邵维斌，路 萍，夏春英，李 忻，荀 康

（镇江市第一人民医院肾脏内科，江苏 镇江 212002）

晚期糖基化终产物对体外培养人腹膜间皮细胞上皮-间叶转化的影响

邵维斌，路 萍，夏春英，李 忻，荀 康

（镇江市第一人民医院肾脏内科，江苏 镇江 212002）

目的 建立晚期糖基化终产物（AGEs）诱导体外培养人腹膜间皮细胞上皮-间叶转化（Epithelial-to- Mesenchymal Transition，EMT）的模型。方法 体外培养的人腹膜间皮细胞经含40mM、80mM AGEs的M199培养基分别培养48、72小时；以正常M199培养基和含80mM BSA的M199培养基为对照。采用相差显微镜观察细胞形态学改变，运用实时荧光定量PCR法检测mRNA的表达情况；运用Western 印迹法检测蛋白的表达情况。结果 （1）AGEs刺激后人腹膜间皮细胞由典型的上皮细胞形态逐渐变为梭形及不规则形，类似肌成纤维细胞；（2）AGEs刺激后，人腹膜间皮细胞胶原蛋白I（CollagenI）mRNA、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA和α-SMA蛋白表达水平显著增加（P＜0.05）；（3）AGEs刺激后，人腹膜间皮细胞E-钙粘蛋白（E-cadherin）mRNA和蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）。结论 AGEs能上调体外培养人腹膜间皮细胞α-SMA、Collagen I表达和下调E-cadherin表达，AGEs诱导人腹膜间皮细胞EMT。

晚期糖基化终产物；间皮细胞；上皮-间叶转化

长期腹膜透析患者，高浓度葡萄糖、晚期糖基化终产物等可引起腹膜间皮细胞发生EMT，导致腹膜会出现新生血管和纤维化等结构改变，这些腹膜结构改变是腹膜功能衰竭的主要原因[1，2]。为建立体外培养人腹膜间皮细胞EMT模型，我们设计了本研究。

1 材料与方法

1.1 原代人腹膜间皮细胞的培养

按文献[3]进行人腹膜间皮细胞体外培养、传代及鉴定。

1.2 分组

（1）对照组，M199培养基；（2）BSA组，含80 m M牛血清白蛋白（BSA）的M199培养基，（3）40 m M AGEs组，含40 mM AGEs-BSA的M199培养基；（4）80 m M AGEs组，含80 mM AGEs-BSA的M199培养基；第3代人腹膜间皮细胞经上述各组培养基分别培养48、72小时后收集细胞。

1.3 实时定量PCR检测

胶原蛋白I、α-平滑肌肌动蛋白、E-钙粘蛋白mRNA 的表达 参照文献[4-5]方法抽提细胞总RNA及运用实时定量PCR试剂盒检测mRNA的表达情况，按公式2-△△Ct求出E-cadherin、α-SMA、Collagen I mRNA表达的相对变化量。

1.4 Western 印迹法检测E-钙粘蛋白、α-平滑肌肌动蛋白的表达[4-5]

上述各组的人腹膜间皮细胞经裂解、离心后，裂解蛋白经凝胶电泳后电转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭，分别加入E-cadherin抗体、α-SMA抗体和β-actin抗体4℃过夜，洗膜后加辣根过氧化酶标记的人抗小鼠IgG抗体，洗膜后加ECL试剂，X线自显影显示结果。

1.5 统计学方法

运用SAS软件进行统计分析，各组间计量资料比较用方差分析，两两比较用Student-Newman-Keals 检验。统计学显著性定义为P＜0.05。

2 结 果

2.1 晚期糖基化终产物对体外培养人腹膜间皮细胞引起细胞形态学变化的影响

在对照组及BSA组，体外培养人腹膜间皮细胞呈铺路石状，在40AGEs组和80AGEs组体外培养人腹膜间皮细胞48小时后人腹膜间皮细胞失去原来的铺路石状形态，逐渐拉长，72小时后细胞出现明显的似成纤维细胞样形态改变（呈梭形或不规则形、部分细胞出现互相交叉重叠）。

2.2 晚期糖基化终产物对人腹膜间皮细胞E-cadherin、α-SMA、Collagen I mRNA表达的影响

实时定量PCR检测结果显示，与对照组及BSA组相比，在40AGEs组和80AGEs组体外培养人腹膜间皮细胞48、72小时后，α-SMA mRNA、Collagen I mRNA表达水平显著上升（P＜0.05）。见图1、图2。而E-cadherin mRNA表达水平显著下降（P＜0.05）。见图3。

2.3 晚期糖基化终产物对人腹膜间皮细胞E-cadherin、α-SMA蛋白表达的影响

Western印迹结果显示，与对照组及BSA组相比，在40AGEs组和80AGEs组体外培养人腹膜间皮细胞48、72小时后，α-SMA蛋白表达水平显著上升（P＜0.05）。见图4。而E-cadherin 蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）。见图5。

图1 各组间皮细胞α-SMA mRNA的相对表达量

图2 各组间皮细胞CollagenI mRNA的相对表达量

图3 各组间皮细胞E-cadherin mRNA的相对表达量

图4 各组间皮细胞α-SMA 蛋白的相对表达量

图5 各组间皮细胞E-cadherin 蛋白的相对表达量

3 讨 论

在我国，腹膜透析已成为越来越多终末期肾衰患者首选肾替代治疗方式。然而随着腹膜透析长期进行，腹膜间皮细胞会出现表型改变，发生EMT，参与腹膜出现新生血管形成及透明样血管病变、纤维化等病理改变，从而导致腹膜功能衰竭。但目前对于腹膜间皮细胞膜EMT在腹膜纤维化和新生血管形成等腹膜病理改变过程中的作用和机制尚不完全清楚。

我们先前研究发现高浓度葡萄糖及晚期糖基化终产物能诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT[4，5]，且晚期糖基化终产物能在蛋白和mRNA水平上上调体外培养大鼠腹膜间皮细胞TGF-β1、VEGF基因表达[5]，提示腹膜间皮细胞膜EMT可能在腹膜纤维化、新生血管形成等病理改变过程中起重要作用。我们的这些研究是以大鼠腹膜间皮细胞为模型进行的，为了进一步探讨腹膜间皮细胞膜EMT在腹膜腹膜损伤过程中的作用和机制，需要建立人腹膜间皮细胞EMT体外模型。我们在本研究中发现：AGEs不仅能引起体外培养人腹膜间皮细胞形态改变，而且AGEs还能上调人腹膜间皮细胞α-SMA、Collagen I mRNA和α-SMA蛋白表达水平和下调人腹膜间皮细胞E-cadherin mRNA和蛋白表达水平，表明AGEs诱导了人腹膜间皮细胞上皮-间叶转化。我们研究结果为进一步探讨腹膜透时腹膜损伤机制提供了体外模型及实验基础。

[1] Devuyst O,Margetts PJ,Topley N.The pathophysiology of the peritoneal membrane.J Am Soc Nephrol,2010,21:1077–1085

[2] Mehrotra R,Devuyst O,Davies SJ,et al. The Current State of Peritoneal Dialysis. J Am Soc Nephrol,2016,27:3238-3252

[3] 邵维斌,钱家麒.从网膜组织法培养人腹膜间皮细胞.肾脏病与透析肾移植杂志,2001,10:92-94

[4] 邵维斌,荀 康,李 忻,等.高浓度葡萄糖诱导人腹膜间皮细胞上皮-间叶转化.实用临床医药杂志,2010,17:4-7.

[5] 邵维斌,彭淑娟,夏春英,等,晚期糖基化终产物能诱导大鼠腹膜间皮细胞上皮-间叶转化.实用临床医药杂志,2011,19:6-9.

本文编辑：吴玲丽

Effects of advanced glycation end products on epithelial mesenchymal transition in cultured human peritoneal mesothelial cells

SHAO Wei-bin, LU Ping, XIA Chun-Ying, LI Xin, XUN Kang
(Department of Nephrology, The First People’s Hospital of Zhenjiang City, Jiangsu Zhenjiang 212002, China)

Objective To establish a Epithelial-to- Mesenchymal,Transition（EMT) model of human peritoneal mesothelial cells induced by advanced glycation end products (AGEs) in vitro. Methods The human peritoneal mesothelial cells were cultured for different time (48 hours and 72 hours) in culture medium containing different concentrations of Advanced glycation end products (40mM、80mM)，M199 meudim and medium with M199 meudim containing 80mM BSA as negative control,Then phenotype changes of human peritoneal mesothelial cells were observed by light microscopy;Then the expression of α-smooth muscle actin(α-SMA) mRNA,collagen I mRNA,E-cadherin mRNA was determined with real time fluorescence quantitative PCR; The protein levels of α-SMA and E-cadherin were determined with Western blotting. Results (1) Phenotype changes of human peritoneal mesothelial cells were observed in Advanced glycation end products group including loss of classic epithelial phenotype and acquirement the appearance similar to myofibroblast.(2)Compared with the control group,AGEs significantly upregulated the expression of Collagen I mRNA ,α-smooth muscle actin(α-SMA) mRNA and protein (P＜0.05),(3) Compared with the control group,AGEs significantly downregulated the E-cadherin mRNA and protein expression(P＜0.05) in the human peritoneal mesothelial cells. Conclution Advanced glycation end products can induce epithelial-to- mesenchymal transition of human peritoneal mesothelial cells，which is proved by downregulation of E-cadherin expression and upregulation of α-SMA and Collagen Iexpression .

Peritoneal mesothelial cells;Epithelial-to-mesenchymal transition;Advanced glycation end products

R459.5

A

ISSN.2095-8242.2017.32.6147.03

镇江市科技项目（SH2013051）

邵维斌（1967-），男，江苏如东人，主任医师