假性醛固酮减少症Ⅱ型的分子遗传学研究进展

假性醛固酮减少症(PHA)是指醛固酮水平正常或升高，但由于机体对内源性醛固酮反应性降低而表现出醛固酮减少相关症状的一类疾病。该病可分为Ⅰ型的与Ⅱ型, PHAⅠ型的特点为盐丢失，表现为低钠性脱水及低血压。PHA Ⅱ型临床表现为高血钾、高血压、低肾素、代谢性酸中毒，但肾小球滤过率正常[1]，是一种罕见的常染色体遗传病。该病于1964年由Paver和Pauline首先报道，其患病率目前尚不清楚，呈家族性发病，亦有散发病例报道[2-3]。

PHA Ⅱ分为5个亚型，分别为PHA ⅡA、PHA ⅡB、PHA ⅡC、PHA ⅡD和PHA ⅡE, 其中PHA ⅡA亚型的致病基因定位于1q31-q42，尚未被克隆，其他4个亚型的致病基因已被克隆，分别是WNK4、WNK1、KLHL3和CUL3基因，通常以显性方式遗传，少数PHA ⅡD也以隐性方式遗传。

1 1q31-q42与PHA ⅡA

PHA ⅡA又称家族高钾性高血压、Gordon综合征。Mansfield等[4]于1997年通过对8个常染色体显性遗传的PHA Ⅱ家族研究初步发现，PHA ⅡA与染色体1q31-q42有关，其连锁系数(LOD)为3.95。之后未见1q31-q42与PHA ⅡA关系的进一步研究。至今PHA ⅡA的致病基因未被克隆。

2 WNK4与PHA ⅡB

2001年Wilson等[5]将PHA ⅡB的致病基因WNK4基因定位于17q21.2，该基因含19个外显子，基因全长16 kb。WNK4属于赖氨酸缺乏蛋白激酶(WNK)家族，该家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因在激酶功能域缺乏保守的赖氨酸而得名，其主要作用为调控钾-氢交换和钠-氯吸收。WNK家族共有4个成员，分别是WNK1、WNK2、WNK3 和WNK4，其中WNK4 和 WNK1异常分别导致 PHA ⅡB和PHA ⅡC[6]。

目前已经发现8种WNK4基因突变与PHA ⅡB有关，突变形式为错义突变和无义突变[1,7-10], 突变位点位于外显子7和17，如Arg1185Lys、Glu562Lys、Asp564Ala、Lys1169Glu、Gln565Glu、Glu560Gly、Pro561Leu、Asp564His，这些突变均导致WNK4基因功能改变[11]。

WNK4基因的主要功能是抑制位于远曲小管肾小管上皮细胞膜的噻嗪敏感性钠-氯协同转运蛋白(NCC)。WNK1、WNK4基因突变均可增强NCC 活性，导致钠重吸收增加[12]。另外，Ring等[13]发现WNK4基因可以通过影响网格蛋白介导的胞吞过程调节肾脏外髓钾通道的表达情况，WNK4基因突变使钾通道在细胞表面表达减少，导致肾脏泌钾减少进而引起体内血钾升高。WNK4基因表达的WNK4蛋白和糖皮质激素诱导激酶可通过相互磷酸化，影响肾脏上皮钠通道的活性，编码WNK4蛋白的基因发生功能获得性突变增加了该部位钠通道的活性，进而增加体内电解质重吸收，同时减少钾离子的分泌，最终导致体内水钠潴留和高血钾症[14]。WNK4基因突变可能通过多种机制参与PHA ⅡB的发生。

3 WNK1与PHA ⅡC

2001年Wilson等[5]将PHA ⅡC的致病基因WNK1基因定位于12p13.33，该基因含有28个外显子，基因全长为156 kb。WNK1基因是WNK家族中首个被发现的成员，它有多个转录起始点，在不同组织有不同的转录产物。Delaloy等[15]还在WNK1基因的外显子1中发现了2个启动子。WNK1蛋白表现为2种形式：肾脏特异性WNK1 (KS-WNK1) 和 全长WNK1 (L-WNK1)，前者缺乏激酶活性，后者具有丝氨酸苏氨酸激酶活性。L-WNK1蛋白可以通过血清糖皮质激素激酶(SGK)调节上皮细胞钠通道(ENaC)活性，L-WNK1蛋白通过诱导SGK磷酸化，使磷酸化泛素连接酶Nedd4-2蛋白磷酸化并抑制其功能，而Nedd4-2蛋白可通过网格蛋白依赖机制促进 ENaC 胞吞从而使其活性减少[16]，因此，WNK1基因功能获得性突变增强了对Nedd4-2的抑制，从而增强ENaC活性，引起钠离子重吸收增多，导致容量性高血压。进一步研究发现，WNK1基因能激活亚硒酸合酶1相关富含脯氨酸-丙氨酸的蛋白激酶(SPAK)，继之磷酸化NCC，促进远曲小管处钠氯的重吸收，同样引起容量性高血压[17]。L-WNK1蛋白通过抑制ROMK减少钾离子的排泄，而KS-WNK1蛋白抑制L-WNK1对ROKM的作用，并不能激活ENaC[14]。因此，当 L-WNK1/KS-WNK1 的比值>1时，可通过ROMK降低钾排泄率，引起血钾升高[18]。

目前，已发现2种与PHA ⅡC有关的WNK1基因突变，突变形式均为1号内含子的大片段缺失突变。2000年，Disse-Nicodème等[19]在PHA ⅡC家系中发现WNK1基因内含子1中存在22 kb的大片段缺失。次年，Wilson等[5]在WNK1基因内含子1中发现了41 kb的大片段缺失，并证实携带22 kb缺失的患者白细胞中WNK1基因转录物水平比未携带22 kb缺失的亲属高5倍，证明了WNK1基因的大片段缺失增强WNK1蛋白的表达。

4 KLHL3与PHA ⅡD

2000年，Lai等[20]首次将PHA ⅡD致病基因KLHL3定位于5q31.2，该基因含17个外显子，基因全长约120 kb。2012年，Boyden等[21]对52个PHA Ⅱ家系，包括126例受累者的研究发现，KLHL3基因中的显性和隐性突变均可导致PHA ⅡD，说明PHA ⅡD既可显性遗传，又可隐性遗传。Louis-Dit-Picard等[22]通过体外远曲小管细胞RNA干扰KLHL3蛋白后发现细胞膜NCC表达增加，与暴露于低渗低氯培养基诱导的NCC高表达相似，表明KLHL3蛋白抑制NCC膜表达。

免疫共沉淀研究显示KLHL3蛋白和NCC之间存在相互作用，进一步验证了KLHL3蛋白是NCC表达的调节因素之一。Lin等[23]构建了携带M131V错义突变的KLHL3敲入小鼠，该小鼠的基因突变与人类KLHL3的M78V突变相对应，研究结果发现，该突变未引起KLHL3蛋白的变化，KLHL3蛋白与WNK1、WNK4蛋白结合完整，但与CUL3蛋白的亲和力降低，导致WNK1、WNK4蛋白的降解失效，下游SPAK/OSR1-NCC磷酸化级联增强，引起小鼠表现出典型的PHAⅡ表型。KLHL3基因突变导致KLHL3蛋白抑制NCC膜表达的作用减弱，靶器官细胞膜NCC表达增加，促进钠氯重吸收，引起高容量性高血压。

目前共发现36种KLHL3基因突变与PHA ⅡD有关，突变形式有错义、无义、缺失和剪切位点突变，其中既有显性突变，又有隐性突变。Boyden等[21]发现KLHL3基因隐性突变分布在整个编码区，而KLHL3基因显性突变呈明显的聚集，如16个显性突变中有9个改变了δ环的最后4个氨基酸之一，另外3个显性突变聚集在BTB结构域内。

5 CUL3与PHAⅡE

PHAⅡE的致病基因为CUL3基因，该基因定位于2q36.2。研究发现缺失9号外显子的CUL3基因致病突变体CUL3Δ9可使CUL3蛋白自身类泛素化修饰增加，显著降解KLHL3蛋白，导致WNK蛋白因泛素化降解减少而累积，增强NCC 活性，导致钠重吸收增加[24]。牛伟等[25]提出关于PHAⅡE发病机制的新观点，由于CUL3Δ9与光形态建成调控因子9信号小体(CSN)的结合减弱，导致其无法正常去类泛素化修饰，故其类泛素化修饰处于高水平，使KLHL3蛋白被过度降解而导致底物WNK蛋白积累，通过SPAK/氧化应激反应激酶1 (OSR1)通路激活NCC导致PHAⅡE。

目前已经发现17种CUL3基因突变，突变形式有错义、无义、插入、缺失和剪切位点突变。CUL3基因突变集中在与9号外显子剪切有关的部位，如Shao等[26]发现了1个新的同义突变c.1221A>G (p.Glu407Glu) ,Glover等[27]发现CUL3基因中8号内含子的错义突变c.3826T>G，这些均导致9号外显子的跳跃，激活NCC导致PHAⅡE的发生。

PHA Ⅱ是一种罕见的高血压，家族倾向明显，国内报道极少，对该病的病因学以及临床特征的了解均远远不够。提高对该病的认识，应用高通量二代测序等技术手段开展基因突变检测，并以此开展致病机制研究，或许能为高血压的治疗提供新的思路。