芒果皮多酚的微波辅助提取及体外抗氧化活性研究

刘焕云，王艳哲，李敬，李飞

（河北经贸大学 生物科学与工程学院，石家庄 050061）

芒果（Mangifera indica L.），又名檬果、漭果等，其营养价值极高，被誉为“热带果王”，是世界第二大热带水果，在印度、巴基斯坦和中国的广东、广西、海南等地均有广泛种植。芒果皮是其鲜食及加工过程中的主要副产物，约占鲜果重的16%，一般被废弃，既造成巨大的资源浪费，又污染环境。国内外研究表明芒果皮中富含多酚类化合物［1－3］、膳食纤维、果胶等活性物质，具有消除有害自由基、抗氧化、抑菌、食品保鲜等功效［4－6］，可广泛用于食品工业。杜瑜欣等综述了甘蔗多酚在食品、调味品中的应用［7］，黄和等的实验结果表明番石榴多酚对虾肉糜有较好的保鲜效果［8］，目前有关微波技术在芒果皮多酚类物质提取及其保鲜方面的应用尚未见报道。本研究以台农芒果皮为原料，通过单因素及正交试验对微波辅助法提取芒果多酚的工艺条件进行了考察和优化，并采用两种体外抗氧化试验方法，对芒果皮多酚的抗氧化活性进行了研究，并与2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作对比，为开发利用芒果皮作为天然、高效的防腐保鲜剂提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料及试剂

市售海南产“台农1号”芒果，取皮，洗净，于60℃烘干后粉碎并过60目筛，得芒果皮粉，干燥、避光、储存备用；市售鸡蛋。

没食子酸标准品（中检所）；乙醇、甲醇、丙酮、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、邻二氮菲、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、抗坏血酸、H2O2等，以上试剂均为分析纯；配制用水为二次蒸馏水。

1.1.2 主要仪器

XFB-1000新型密封式中药粉碎机 吉首市中诚制药机械厂；723型分光光度计 上海光谱仪器有限公司；WD-800B格兰仕微波炉 顺德格兰仕电器公司；离心机 上海安亭科学仪器厂；电子天平；恒温水浴锅；干燥箱等。

1.2 芒果皮多酚微波辅助提取条件的确定

1.2.1 浸提溶剂的选择

称取芒果皮粉1.0g（准确至±0.0001g），分别加入20mL蒸馏水、50%乙醇、60%乙醇、50%甲醇、50%丙酮中，在微波功率160W下处理20s后，60℃水浴浸提30min，减压过滤得提取液，定容至50.00mL。吸取1.00mL，显色测定吸光度值，计算多酚提取得率。

1.2.2 浸提方法及处理条件的确定

称取芒果皮粉1.0g（准确至±0.0001g），按料液比1∶20（g／mL）加入所选浸提溶剂，分别按如下不同方法浸提：微波法（160W下处理20s）；先微波（160W处理20s）后水浴（60℃，30min）。然后同上操作，计算多酚提取得率，以确定浸提方法。分别对微波辅助提取的浸提剂体积分数、料液比、微波功率、微波处理时间进行单因素试验，在此基础上采用L9（34）正交试验对微波辅助提取芒果皮多酚的工艺条件进行优化，其因素水平见表2，各试验重复2次，取平均值。

1.3 芒果皮提取物多酚含量的测定

参照文献［9］，以没食子酸为标准品，采用酒石酸亚铁法测定芒果皮提取物中的多酚含量，测得没食子酸在0～100μg／mL内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为：A＝0.0107c＋0.0774，A为吸光度值，c为多酚质量浓度（μg／mL），R2＝0.9959。

1.4 芒果皮多酚抗氧化活性的测定

1.4.1 清除DPPH自由基能力的试验

参照郑德勇等［10］的方法，将1.50mL不同质量浓度的芒果皮多酚样液分别加入至2.50mL 6.5×10－5mol／L的DPPH 溶液中，混匀，避光30min后于波长517nm处测定吸光度值。以浸提剂为空白对照，等质量浓度的BHT代替样品作为阳性对照，每个浓度的样品平行测定3次，取平均值。按下式计算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率（%）＝［1－（Ds－Dr）／D0］×100。

式中：Ds为加抗氧化剂后DPPH溶液的吸光度值；Dr为只加抗氧化剂及浸提剂的吸光度值；D0为只加DPPH及浸提剂的吸光度值。

1.4.2 对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用

按文献［11］的方法制备卵黄悬液，于比色管中分别加入卵黄悬液0.20mL、不同质量浓度的芒果皮多酚样液0.10mL。各管再加入0.20mL 25mmol／L的FeSO4溶液，用0.1mol／L pH 值7.4的磷酸缓冲液（PBS）补充至2.00mL，37℃恒温振荡15min。取出后分别加入20%的三氯乙酸（TCA）溶液0.50mL，3500r／min离心10min沉淀蛋白质。再分别吸取上清液2.00mL于试管中，加入0.8%的硫代巴比妥酸（TBA）1.00mL，加塞，放入沸水浴中15min。冷却后于波长532nm处测定吸光度，对照管用60%乙醇溶液代替样品溶液，其他与反应管试剂相同，根据吸光度计算其抑制率［12，13］，同时以等质量浓度的BHT作阳性对照。

1.5 数据统计分析

采用SPSS统计软件进行数据分析，多重比较用Duncan新复极差法进行，平均数差异显著性检验用独立样本T-test法进行，同一浓度下，与对照组相比，“＊＊”表示差异极显著（p＜0.01），“＊”表示差异显著（p＜0.05），不标者则为差异不显著（p＞0.05），重复数n＝3。

2 结果与分析

2.1 芒果皮多酚提取工艺参数的确定

2.1.1 提取溶剂的确定

不同溶剂对芒果皮多酚的提取结果见表1。

表1 不同溶剂对多酚的浸提效果Table1 Effects of extraction solvents on the yield of polyphenols

由表1可知，乙醇溶液对芒果皮多酚浸提的效果较好，水提法多酚得率最小，且提取物中杂质成分较多，不易保存，而20%以上的乙醇溶液有一定防腐功能，且相比于甲醇和丙酮无毒性，易回收，故本试验选择乙醇溶液作为提取溶剂。

2.1.2 微波辅助法提取工艺参数的确定

按1.2.2节方法比较了微波与微波加水浴加热法对芒果皮多酚提取得率的影响。结果表明：微波加水浴的辅助提取法的得率较前者提高了0.57%，故本试验选用微波辅助法。由表1可知，乙醇与水的复合体系提取多酚得率较高，且无毒性和环境污染，不同体积分数的乙醇溶液对多酚提取得率的影响显著，50%乙醇极显著优于其他；在料液比1∶20～1∶30（g／mL）时，多酚得率显著增加，提取完全之后变化缓慢；微波处理时间在10～30s，随着时间的延长，多酚得率显著增加，之后下降（p＜0.01）；微波功率对多酚提取有极显著影响（p＜0.01），功率高于320W或时间较长，多酚结构可能会改变［14］，见表2。在单因素试验基础上，选择L9（34）正交表进行试验，以多酚得率为评价指标确定较佳提取工艺条件，结果见表3和表4。

表2 不同条件对多酚得率的影响Table2 The effects of different conditions on the yield of polyphenols

表3 正交试验结果Table3 Orthogonal experimental results

表4 正交试验的方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal experiment

方差分析表明，A、B、D 3个因素对多酚提取得率有极显著影响，C因素对芒果皮多酚提取得率有显著影响。4个因素影响大小的顺序为：A＞D＞B＞C。微波辅助提取芒果皮多酚较佳的工艺条件为A2B2C2D1，即芒果皮粉中加入30倍浓度为60%的乙醇溶液，微波功率160W处理30s后，于60℃水浴浸提30min，在此条件下重复验证试验3次，芒果皮多酚提取得率为（6.24±0.02）%。

2.2 芒果皮多酚抗氧化活性的测定

2.2.1 芒果皮多酚对DPPH自由基的清除作用

图1 芒果皮多酚对DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH radical scavenging ability of polyphenols from mango peel注：“＊＊”表示差异极显著。

分别配制不同质量浓度的芒果皮多酚溶液和BHT溶液进行清除DPPH自由基试验。由图1可知，芒果皮多酚对DPPH自由基具有较强的清除作用，且在试验范围（4.65～58.13μg／mL）内，呈明显的剂量-效应关系。当浓度为4.65μg／mL时其清除率就达到了52.2%，说明芒果皮多酚粗提物中含有氢供体，并且可以提供氢质子，能够使具有高度氧化性的自由基还原。T检验法分析表明，在同等条件下芒果皮多酚对DPPH自由基的清除率极显著高于BHT。

2.2.2 芒果皮多酚对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制能力

图2 芒果皮多酚对卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率Fig.2 Inhibition rate of mango peel polyphenols on lipid peroxidation of yolk lipoprptein注：“＊＊”表示差异极显著。

以卵黄脂蛋白溶液为脂质过氧化体系，测定芒果皮多酚对脂质过氧化的抑制作用，并用BHT作阳性对照。由图2可知，BHT对Fe2＋诱导的卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制作用明显优于芒果皮多酚。随着芒果皮多酚质量浓度的增加，其抑制率呈现小幅度连续上升的趋势，在浓度超过46.5μg／mL后，抑制率有明显提高；在浓度为58.13μg／mL 时，抑制率可达59.04%。相比之下，在浓度为4.65μg／mL时，BHT对卵黄脂蛋白脂质过氧化有较强的抑制作用，抑制率达68.74%，极显著高于同质量浓度下芒果皮多酚的抑制率。浓度超过34.88μg／mL时，抑制率达90.98%，之后抑制率趋于平缓。

3 讨论

芒果资源丰富，其加工过程中大量皮、核等副产品未被利用，近年来，有关学者对芒果植物中的生物活性物质进行了研究，结果表明芒果果皮提取物含有丰富的多酚类化合物，具有较强的抗氧化和抑菌作用，其中张国治等［15］以市购芒果为原料、41%乙醇溶液为浸提剂加入0.19%偏磷酸钠，65℃，89min，多酚平均提取得率为1.41%；杨郑州等以广西百色市塘兴村采摘的台农、贵妃、金煌芒3个品种的芒果皮和芒果叶干粉末（过40目筛）为原料，以40%乙醇溶液为浸提剂，静置30min后用超声波振荡40min，3种芒果以台农芒果叶片和果皮多酚含量最高，分别为叶片10.091mg／g、果皮11.518mg／g。贾桂云等［16］以金煌芒果皮粉末为原料，70%乙醇溶液震荡提取30min，重复2次，采用福林酚试剂法测得芒果皮中多酚含量为40.00GAEmg／g。本试验以60%乙醇溶液为浸提剂，采用微波辅助法提取台农芒果果皮中的多酚类物质，多酚提取得率为（6.24±0.02）%，微波提取显著提高了多酚得率，节省了时间，避免了活性物质结构改变，武娇等［17］的研究结果也证明了这一点。谢倩等［18］以没食子酸为标准品，加标回收率实验说明酒石酸铁法和福林酚试剂法测得的多酚含量差异不显著（p＞0.05）。因此，微波辅助法提取具有一定的应用推广价值。

很多疾病如癌症、冠心病及衰老等的发生与富含抗氧化剂食品的摄入量呈负相关，天然抗氧化剂在食品保鲜、药品、化妆品行业应用广泛，具有抗氧化和抑菌作用的果蔬等成为研究热点。体外抗氧化试验结果表明芒果皮多酚粗提物对DPPH自由基和卵黄脂蛋白过氧化的抑制作用都随着质量浓度的增加而逐渐提高，尤其对DPPH自由基的清除能力较强，其效果极显著高于BHT，这一结果与杨郑州等的抗氧化活性试验结果相符。对卵黄脂蛋白脂质过氧化有一定的抑制作用，但极显著低于BHT。芒果皮多酚粗提物已表现出良好的抗氧化作用，其多酚组成、结构及抗氧化机理还有待进一步探讨，另外，样液的浓度梯度还有待进一度增大。

4 结论

微波辅助法提取芒果皮多酚的较佳工艺条件为：浸提乙醇溶液浓度60%，料液比为1∶30（g／mL），在微波功率160W处理30s，于60℃水浴浸提30min，芒果皮多酚提取得率为（6.24±0.02）%，明显高于单独微波法。体外抗氧化试验结果表明，芒果皮中多酚表现出较好的抗氧化作用，可作为天然抗氧化剂和防腐保鲜剂进行深入研究和开发。