响应面法优化红提果醋的发酵条件

杨丽萍，单春会，唐凤仙

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832003）

红提葡萄，又称红地球葡萄，是美国加州大学研制的杂交品种［1］。红提因其穗大、皮厚、味美、耐贮运等优点而深受大众喜爱［2］。新疆是我国红提种植的主要区域［3］，但长期以来红提都以鲜食为主，且基本为季节性产品，由于红提产业化商品市场几乎空白，致使红提产业发展严重滞后［4］。

果醋是以水果或水果下脚料为原料，先酒精发酵再醋酸发酵而得到的新型饮料［5］。果醋因其降三高、抗菌、促进新陈代谢、抗衰老等众多优点而受消费者推崇，是一款较好的功能性饮料［6］。果醋发酵方法分为固态发酵法、液态发酵法和前液后固发酵法［7］，固态发酵法是传统发酵方法，液态发酵法则是新兴的主流发酵方法，前液后固法则结合两者的优缺点，其发酵方法尚不成熟［8］。

随着人们对于食品健康及安全愈发重视，果醋因其保健功能及口感酸爽而越发受到关注［9］。但我国自主研发生产的果醋品种较为单一［10］，沙棘果醋、菠萝果醋、黑加仑果醋、梨果醋等大多停留在实验室阶段［11－14］。本文针对红提深加工产品较少以及其果醋产品报道较少的问题，采用响应面法优化红提果醋的发酵工艺条件，以期酿造出口感柔和、色泽优良、典型性强的红提果醋，为其工业化生产提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红提葡萄：新疆石河子市；安琪葡萄酒活性干酵母（BV818）：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌（泸酿1.01）：由石河子大学食品学院果蔬实验室保藏；果胶酶（EX-V）：法国曼森公司；优质白砂糖（食品级）：市售；葡萄糖（分析纯）：天津盛奥化学试剂有限公司；偏重亚硫酸钾、柠檬酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-ZD无菌操作台 苏州苏洁净化设备有限公司；YXQ-LS-SⅡ高压蒸汽灭菌锅 济南思卓医疗器械有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技有限公司；ZXSD-1160生化培养箱、ZWYRD2403触摸屏摇床 上海智城分析仪器制造有限公司；S-3CpH 计 上海精密科学仪器有限公司；MC202231手持糖度计 成都泰华光学有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 红提果醋液态发酵工艺流程

原料→分拣清洗→除梗破碎→成分调整→灭菌→酒精发酵→过滤→杀菌→醋酸发酵→澄清→过滤→杀菌→陈酿→成品。

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 原料预处理

选用新鲜红提，拣出坏果、次果、杂质；清洗后沥干，破碎（注意葡萄籽不破碎）；加入总体积0.006%的偏重亚硫酸钾；依据1.7g糖发酵可生成1%酒精，按预计酒度加入白砂糖调整葡萄果浆糖浓度；用柠檬酸调节发酵液酸度至pH 3.8；加入发酵液总体积0.03%的果胶酶于葡萄果浆内以达到提高出汁率的效果；68℃下巴氏杀菌30min。

1.3.2.2 酵母活化

称取发酵液总体积0.03%的酿酒活性干酵母于5%葡萄糖溶液中，于37℃条件下水浴活化30min。

1.3.2.3 酒精发酵

待发酵液冷却后接入已活化的酵母菌液；将发酵液放入20℃恒温培养箱中，每隔一段时间测量发酵液的可溶性固形物，待酒精度达到8%左右时停止酒精发酵；200目纱布粗滤后，6000r／min条件下离心10min，然后在68℃下巴氏杀菌30min。

1.3.2.4 醋酸菌培养及驯化

醋酸菌培养：首先将醋酸菌接种至固体培养基中进行1次活化培养，挑选长势良好的醋酸菌接入液体培养基中在摇床中（180r／min，30℃）进行二次扩大培养。

醋酸菌驯化：将醋酸菌接入驯化培养液与红提果酒（8∶2）混合的培养液中培养48h得到一级种子液，取一级种子液接入驯化培养液与红提果酒（6∶4）得到二级种子液，以此类推直至四级种子液接入纯红提果酒中，此时得到的醋酸菌用于后续醋酸发酵。

1.3.2.5 醋酸发酵

在红提果酒中接入已驯化的醋酸菌放置在摇床（180r／min，30℃）中进行有氧醋酸发酵，每天监控发酵液的酒精含量及总酸含量，在酸度不再上升时结束醋酸发酵。

1.3.2.6 后处理

红提果醋中加入明胶、皂土，静置澄清96h；4000r／min条件下离心10min；过滤；100℃条件下杀菌10min得到成品果醋。可依据喜好进行调配。

1.3.3 红提果醋发酵的单因素试验

选择不同初始酒精度（4%，5%，6%，7%，8%）、不同发酵温度（26，28，30，32，34℃）、不同冰醋酸添加量（0，0.5%，1%，1.5%，2%）、不同醋酸菌接种量（6%，8%，10%，12%，14%）4个因素进行单因素试验，试验结果以产品酸度为评价标准来确定合适的发酵条件范围，以便进行后续响应面优化试验。

1.3.4 红提果醋响应面优化试验

在单因素试验的基础上，以初始酒精度、醋酸菌接种量、发酵温度和冰醋酸添加量4个因素为自变量，以红提果醋酸度为响应值，设计4因素3水平响应面分析试验，以Design-Expert V8.0.6软件对试验进行回归分析，响应面试验因素和水平见表1。

表1 响应面设计试验因素水平与编码Table1 Independent variables and levels of the response surface design

1.3.5 测定方法

可溶性固形物：手持折光仪［15］；酸度：酸碱中和滴定法［16］；酒精度：蒸馏比重法［17］。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 初始酒精度对红提果醋发酵的影响

图1 初始酒精度对酸度的影响Fig.1 Effect of initial alcohol content on acidity

由图1可知，在其他因素相同的条件下，初始酒精度为4%，5%时发酵液醋酸转换率较低，酸度较小；当初始酒精度为6%时，发酵液酸度达到最大值6.89g／dL；当初始酒精度不断增大时，发酵液醋酸转换率反而减弱。这可能是因为当发酵液酒精度较小时，不能满足醋酸菌的生长代谢，导致产酸能力差；当发酵液酒精度过高时，醋酸菌的活性又被抑制，从而导致产酸能力减弱［18］。因此，确定初始酒精度6%比较适合醋酸菌的生长。

2.1.2 醋酸菌接种量对红提果醋发酵的影响

图2 醋酸菌接种量对酸度的影响Fig.2 Effect of inoculation amount of acetic acid on acidity

由图2可知，随着醋酸菌接种量的增加，果醋酸度呈现先上升后下降的趋势；当接种量为10%时，酸度达到峰值6.78g／dL；接种量超过10%，酸度逐渐降低。这可能是因为接种量越大，醋酸菌生长所需要的营养物质也越多，但发酵液中的营养物质有限，过多接种醋酸菌反而使其彼此竞争，导致醋酸产量减少。因此，确定醋酸菌接种量10%左右较为适宜。

2.1.3 发酵温度对红提果醋发酵的影响

图3 发酵温度对酸度的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on acidity

由图3可知，当发酵温度在26～30℃时，发酵液酸度呈现上升趋势；发酵温度为30℃时酸度最高；随着发酵温度的升高，发酵液酸度出现降低趋势，当温度超过32℃时，发酵液酸度明显降低。这可能是因为发酵温度过低时，醋酸菌无适宜的生长环境，活力较弱；发酵温度过高时，则导致醋酸菌生长过快，菌体老化，产酸能力变弱。因此，确定发酵温度为30℃左右较为合适。

2.1.4 冰醋酸添加量对红提果醋发酵的影响

图4 冰醋酸添加量对酸度的影响Fig.4 Effect of additive amount of glacial acetic acid on acidity

由图4可知，发酵液酸度随着冰醋酸添加量的变化呈现先增长后减弱的趋势，冰醋酸添加量从0%变化至0.5%时，醋酸含量明显增高；在冰醋酸添加量为1%时酸度达到最高值6.82g／dL；当冰醋酸添加量超过1%时，发酵液酸度逐渐降低。这可能是因为在发酵液中添加适量的冰醋酸能够调整其酸度，使之更适宜醋酸菌生长，但当冰醋酸添加量过多时，造成发酵液酸性增强，抑制醋酸菌活性，降低了醋酸菌的产酸能力。因此，确定冰醋酸添加量为1%时较适合醋酸菌的生长。

2.2 响应面试验优化结果

为确定红提果醋各因素的最优工艺参数，采用响应面软件设计4因素3水平的响应面优化试验，以发酵液酸度为响应值，结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果Table2 Experimental design and result of response surface analysis

2.2.1 回归模型的建立及方差分析

应用 Design-Expert V8.0.6软件对表2中的试验数据进行回归分析，得到红提果醋酸度（X）的回归方程为：X＝6.84＋0.042A＋0.11B＋0.084C＋0.062D－0.032AB＋0.065AC－0.052AD＋0.02BC＋0.015BD＋0.018CD－0.65A2－0.6B2－0.51C2－0.68D2，对二次回归方程进行分析，其显著性结果见表3。

表3 醋酸含量回归模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model on acetic acid content

由表3可知，模型P值＜0.01，说明该模型极显著；失拟项P＞0.05，表现为不显著；该模型一次项、二次项均达到显著水平，说明各因素对试验影响都较大，交互项仅AC显著，其他均为不显著，说明初始酒精度与冰醋酸添加量之间的相互影响较大，其他因素两两之间影响较小；由F值可看出各因素的影响顺序依次为：B＞C＞D＞A，即醋酸菌接种量＞冰醋酸添加量＞发酵温度＞初始酒精度；决定系数R2＝0.9746＞0.9，说明该模型能很好地表达试验结果，仅3%的变化不能用此模型来解释，该方程拟合度较好，模型预测值与实际值有较好的关联性。

2.2.2 响应面分析及优化

图5 各因素交互作用对果醋酸度影响的响应面图Fig.5 Three-dimensional response surface diagram showing the interactive effects of different factors on acidity of fruit vinegar

响应面可以反映出各个因素间交互作用的显著性，曲面变化相应表现为响应值变化的大小［19］。由图5可知，初始酒精度、醋酸菌接种量、冰醋酸添加量、发酵温度4个因素之间存在交互作用。图5中a为初始酒精度与醋酸菌接种量的交互结果：响应曲面坡度较陡峭，且醋酸菌接种量坡度更为陡峭，说明二者交互作用显著，醋酸菌接种量的影响大于初始酒精度的影响；图5中b为冰醋酸添加量与初始酒精度的交互结果：等高线呈椭圆形，且冰醋酸添加量坡度明显大于初始酒精度，说明二者交互作用显著，冰醋酸添加量的影响大于初始酒精度的影响；图5中c，d，e响应面图均呈现先上升后下降的趋势，有明显的最大值，且等高线图均呈椭圆形，说明其两两之间交互作用都较为显著；图5中f为发酵温度与冰醋酸添加量的交互结果：响应面较为平缓，且等高线呈圆形，说明二者交互作用不显著。

2.2.3 响应面验证试验

通过响应面分析，得到最佳发酵条件为初始酒精度6.03%，醋酸菌接种量10.19%，冰醋酸添加量1.04%，发酵温度30.09℃，在此条件下发酵得到的红提果醋酸度为6.85g／dL；考虑到实际操作的便利性，将最佳条件调整为初始酒精度6%，醋酸菌接种量10%，冰醋酸添加量1%，发酵温度30℃，经3次重复试验，实际红提果醋酸度均值为6.79g／dL；实际结果与理论值偏差较小，表明该模型能较好地预测红提果醋发酵工艺条件，具有实际应用价值。

3 结论

通过对单因素初始酒精度、醋酸菌接种量、发酵温度、冰醋酸添加量对红提果醋发酵过程中酸度的影响进行考察，利用响应面法对各因素之间的交互作用进行分析。得到以下结论：（1）4个单因素对红提果醋产酸的影响顺序为醋酸菌接种量＞冰醋酸添加量＞发酵温度＞初始酒精度。（2）最佳发酵条件为初始酒精度6%，醋酸菌接种量10%，冰醋酸添加量1%，发酵温度30℃；在此条件下得到酸度为6.79g／dL的红提果醋。（3）响应面法预测理论值经实际验证后，与实际结果相差无几，说明此响应面模型具有实际价值。