枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对抗生素耐受性的研究

高娟娟，贾丽艳＊，田宇敏，郭晋田，甄晓君，郝林

（1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；2.山西潞城市圣堂食品有限公司，山西 潞城 047500）

益生菌作为一类能够对宿主生理功能产生有益作用的活性微生物，被广泛应用于食品、医药以及畜牧领域［1］。益生菌的主要来源是动物肠道中正常的生理性细菌和非肠道细菌［2］。益生菌在人和动物肠道内，通过栖生、偏生、竞争或吞噬等复杂关系，改善宿主肠道微生物菌群的平衡进而促进食物有益代谢，提高免疫力，防治代谢性疾病，且具有绿色安全、无毒副作用、无残留等特点，作为抗生素的替代品被广泛应用［3－6］。不同的益生菌具有不同的功能，开发多种性能的益生菌是目前的一种研究趋势。

枯草芽孢杆菌CGMCC 6624是本课题组从山西醋醅中分离筛选的1株具有产绿色生物防腐剂细菌素的菌株［7，8］，且该菌株具有良好的生物学特性，对温度、酒精、氯化钠、胆盐、酸碱、表面活性剂和模拟人工胃液和肠液具有一定的耐受性，具有作为益生菌的开发潜力，但是由于目前益生菌在应用过程中容易受到抗生素的影响，对益生菌的功能产生影响。为此本研究在前期研究的基础上，研究枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对抗生素的耐受性，以期为该菌株作为益生菌在食品、饲料中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢杆菌CGMCC 6624：由山西农业大学食品科学与工程学院生物工程实验室提供。

1.1.2 抗生素

β-内酰胺类：阿莫西林、青霉素、氨苄青霉素；氨基糖苷类：庆大霉素、新霉素、链霉素；四环素类：四环素、土霉素；酰胺醇类：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考；大环内酯类：红霉素、阿奇霉素；喹诺酮类：氧氟沙星；硝基咪唑类：甲硝唑、替硝唑；磺胺类：磺胺，均为市购。

1.1.3 仪器

Eppendorf Centrifuge 5417R高速低温离心机 德国Eppendorf公司；GZX-GF101-3-BS-II／H 电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械有限公司；HPX-9272MBE电热恒温培养箱、YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌器、SW-CJ-2FD净化工作台 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZWYR-2102C恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司。

1.1.4 培养基

发酵培养液［9］：葡萄糖1g，酵母浸膏1g，蒸馏水100mL。

牛肉膏蛋白胨培养基［10］：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5g，蒸馏水100mL，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 抗生素溶液的配制

将1g抗生素溶于10mL的无菌水或无水乙醇中，配成0.1g／mL的原液。采用倍比稀释法使其终浓度为10，1，1×10－1，1×10－2，1×10－3，1×10－4，1×10－5，1×10－6mg／mL。

1.2.2 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对抗生素耐受性的测定

采用双层牛津杯法［11］，将已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基加热至完全融化，倒入培养皿中，每皿大约20mL，待其凝固；将融化的牛肉膏蛋白胨培养基冷却到50℃左右，混入0.2mL最佳指示菌浓度为1×106cfu／mL的枯草芽孢杆菌CGMCC 6624，混匀，取5mL加到已凝固的培养基上；将培养皿半敞口，静置于超净台上，待其凝固40min后，在培养基表面垂直放上已灭菌的牛津杯（内径6mm、外径8mm），轻轻按压，使其与培养基没有空隙。将抗生素溶液（5000r／min，5min）取200μL于牛津杯内，4℃静置12h后，30℃培养24h，测定抑菌圈的大小，以上试验均平行3次。

1.3 数据统计分析

采用Excel和Origin 8.5软件完成。

2 结果与讨论

2.1 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对氨基糖苷类抗生素的耐受性

图1 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对氨基糖苷类的耐受性Fig.1 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to aminoglycosides

由图1可知，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对氨基糖苷类抗生素具有不同的耐受性。当抗生素浓度为1.0×10－2mg／mL时，只有链霉素出现抑菌圈，抑菌圈直径为9.34mm；当抗生素浓度为1.0×10－1mg／mL时，链霉素的抑菌圈直径最大，为10.21mm；当抗生素浓度为1.0mg／mL时，庆大霉素的抑菌圈直径最大，为13.01mm。氨基糖苷类抗生素主要是影响细菌蛋白质合成的过程，妨碍初始复合物的合成，诱导细菌合成错误蛋白以及阻抑已合成蛋白的释放，从而导致细菌死亡。主要对大肠杆菌和铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌有很强的杀菌作用，抗菌效果明显［12］。但革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对氨基糖苷类抗生素具有一定的耐受性，其抑菌机理有待进一步研究。总之，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对氨基糖苷类抗生素表现出不同的耐受性，其中对链霉素的耐受性最强，对新霉素的耐受性最弱。

2.2 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对大环内酯类抗生素的耐受性

大环内酯类抗生素是指化学结构中含有内酯环的一大类抗生素，主要通过阻断50S核糖体中肽酰转移酶的活性来抑制细菌蛋白质合成，属于快速抑菌剂，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌性［13］。

图2 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对大环内酯类抗生素的耐受性Fig.2 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to macrolide antibiotics

由图2可知，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对大环内酯类抗生素具有不同的耐受性。当抗生素浓度为1.0×10－2，1.0×10－1mg／mL时，只有红霉素出现了抑菌圈，直径分别为11.31，15.2mm；抗生素浓度为1.0mg／mL时，红霉素的抑菌圈直径最大，为25.13mm。总之，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对大环内酯类抗生素表现出不同的耐受性，其中对红霉素的耐受性最强，对阿奇霉素的耐受性最弱。

2.3 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对β-内酰胺类抗生素的耐受性

β-内酰胺类抗生素是指在化学结构中含有β-内酰胺环的一大类抗生素，它是现有抗生素中使用最广泛的，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌性。β－内酰胺类抗生素能抑制细胞壁粘肽合成酶，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解。动物无细胞壁，不受β-内酰胺类药物的影响，因而本类药具有对细菌的选择性杀菌作用，对宿主毒性小，具有药物毒性低、抗菌活性强、临床治疗效果好并且适应性广的优点［14］。

图3 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对β-内酰胺类抗生素的耐受性Fig.3 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 toβ-lactam antibiotics

由图3可知，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对β-内酰胺类抗生素具有不同的耐受性。当抗生素浓度为1.0×10－2mg／mL时，阿莫西林的抑菌圈直径最大，为11.18mm；当抗生素浓度为1.0×10－1mg／mL时，阿莫西林的抑菌圈直径最大，为19.18mm；当抗生素浓度为1.0mg／mL时，阿莫西林的抑菌圈直径最大，为23.10mm。总之，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对β-内酰胺类抗生素表现出不同的耐受性，其中对青霉素的耐受性最弱，对阿莫西林的耐受性最强。

2.4 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对四环素类抗生素的耐受性

图4 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对四环素类抗生素的耐受性Fig.4 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to tetracycline antibiotics

四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌性。由于其应用方便、抗菌谱广、品种多、价格低廉常被应用到兽药和饲料添加剂中。其作用原理是通过阻碍氨酰tRNA与核糖体结合位点的结合来抑制蛋白合成，进而达到抑菌效果［15，16］。

由图4可知，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对四环素类抗生素具有不同的耐受性。当抗生素浓度为1.0×10－3mg／mL时，四环素的抑菌圈直径最大，为5.01mm；当抗生素浓度为1.0×10－2mg／mL时，四环素的抑菌圈直径最大，为11.18mm；当抗生素浓度为1.0×10－1mg／mL时，四环素的抑菌圈直径最大，为16.19mm；当抗生素浓度为1.0mg／mL时，四环素的抑菌圈直径最大，为21.06mm。总之，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对四环素类抗生素表现出不同的耐受性，其中对土霉素的耐受性最弱，对四环素的耐受性最强。

2.5 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对磺胺类抗生素的耐受性

磺胺类抗生素是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，其抗菌谱较广，对大多数革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌有抑制作用。磺胺类抗生素由于抗菌谱广、性质稳定、价格低廉、品种多、使用便利等优点被用作动物饲养及水产养殖中［17］。

图5 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对磺胺类抗生素的耐受性Fig.5 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to sulfonamides antibiotics

由图5可知，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对不同浓度的磺胺具有不同的耐受性。当磺胺浓度为1.0×10－1mg／mL时，抑菌圈直径为4.57mm；磺胺浓度为1.0mg／mL时，抑菌圈直径为21.17mm。即随着磺胺浓度升高，抑菌圈直径也在增大。

2.6 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对喹诺酮类抗生素的耐受性

图6 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对喹诺酮类抗生素的耐受性Fig.6 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to quinolone antibiotics

由图6可知，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对不同浓度的氧氟沙星具有不同的耐受性。当氧氟沙星浓度为1.0×10－2mg／mL时，抑菌圈直径为9.01mm；当氧氟沙星浓度为1.0×10－1mg／mL时，抑菌圈直径为20.19mm；当氧氟沙星浓度为1.0mg／mL时，抑菌圈直径为22.03mm。即随着氧氟沙星浓度升高，抑菌圈直径也在增大。喹诺酮类抗生素主要是通过抑制菌体内DNA旋转酶及拓扑异构酶IV活性，最终抑制DNA合成而发挥抗菌作用。喹诺酮类抗生素主要作用于革兰氏阴性菌，对革兰氏阳性菌作用较弱［18］。革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对喹诺酮类抗生素具有一定的耐受性，其抑菌机理有待进一步研究。

2.7 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对酰胺醇类抗生素的耐受性

酰胺醇类主要通过抑制细菌蛋白质的合成，与细菌70S核糖体中较大的50S亚基结合，引起细菌死亡，对革兰氏阴性菌的抑制作用强于革兰氏阳性菌，对沙门氏菌敏感，对脑膜炎球菌、流感杆菌和淋球菌杀菌作用强［19］。

由图7可知，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对酰胺醇类抗生素具有不同的耐受性，当抗生素质量浓度为1.0×10－2mg／mL时，氟苯尼考没有出现抑菌圈；当抗生素浓度为1.0×10－1mg／mL时，氯霉素的抑菌圈直径最大，为17.01mm；当抗生素浓度为1.0mg／mL时，氯霉素的抑菌圈直径最大，达到26.16mm。总之，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对酰胺醇类抗生素表现出不同的耐受性，其中对氯霉素的耐受性最强，对氟苯尼考的耐受性最弱。

图7 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对酰胺醇类抗生素的耐受性Fig.7 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to amide alcohol antibiotics

2.8 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对硝基咪唑类抗生素的耐受性

硝基咪唑类是一种具有5-硝基取代咪唑杂环结构的化合物，常见的主要有替硝唑和甲硝唑，硝基咪唑类具有抗菌和抗原虫的作用，同时也具有抗厌氧菌的作用，在水产养殖中广泛应用于寄生虫的防治与感染，在无氧或少氧环境和较低的氧化还原电位下，其硝基易被电子传递蛋白还原成具有细胞毒作用的氨基，抑制细胞DNA的合成，并使已合成的DNA降价，破坏DNA的双螺旋结构或阻断其转录复制，从而使细胞死亡，发挥其迅速杀灭厌氧菌、有效控制感染的作用［20］。

图8 枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对硝基咪唑类抗生素耐受性的研究Fig.8 The resistance of B.subtilis CGMCC 6624 to nitroimidazole antibiotics

由图8可知，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对硝基咪唑类抗生素具有不同的耐受性，当抗生素浓度为1.0×10－5，1.0×10－4，1.0×10－3mg／mL时，甲硝唑没有出现抑菌圈，替硝唑的抑菌圈直径分别为2.01，3.15，4.51mm；当抗生素浓度为1.0×10－2mg／mL时，甲硝唑的抑菌圈直径最大，为12.34mm；当抗生素浓度为1.0×10－1mg／mL时，甲硝唑的抑菌圈直径最大，为20.14mm；当抗生素浓度为1.0mg／mL时，甲硝唑的抑菌圈直径最大，为24.07mm。总之，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对硝基咪唑类抗生素表现出不同的耐受性，其中对替硝唑的耐受性最强，对甲硝唑的耐受性最弱。

3 结论

枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对不同种类的抗生素均具有一定的耐受性。当抗生素浓度为1×10－5～1mg／mL时，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对硝基咪唑类中的替硝唑产生耐受性；当抗生素浓度为1×10－3～1mg／mL时，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对四环素类中的四环素和土霉素，喹诺酮类中氧氟沙星产生耐受性；当抗生素浓度为1×10－2～1mg／mL时，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对β-内酰胺类中的阿莫西林、青霉素和氨苄青霉素，氨基糖苷类中的链霉素，酰胺醇类中的氯霉素、甲砜霉素，大环内酯类中的红霉素和硝基咪唑类中的甲硝唑均产生一定耐受性；当抗生素浓度在1×10－1～1mg／mL时，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对氨基糖苷类中的庆大霉素、新霉素，酰胺类中的氟苯尼考和磺胺类中的磺胺产生耐受性；当抗生素浓度为1.0mg／mL时，枯草芽孢杆菌CGMCC 6624对大环内酯类中的阿奇霉素产生耐受性。以上研究为枯草芽孢杆菌CGMCC 6624作为益生菌在食品及饲料中的应用奠定了理论基础。