种曲工艺参数优化及其在酱油生产中的应用

王惠芳，樊君，荣秋亮，罗红刚，刘书亮

（1.四川农业大学 食品学院，四川 雅安 625014；2.千禾味业食品股份有限公司，四川 眉山 620010）

酱油是人们生活中必不可少的调味品。随着人们生活水平的改善，对酱油品质的要求也越来越高。种曲作为酱油酿造的关键因素，对酱油的品质至关重要。优质的种曲可提高出品率以及提升风味、口感和感官体态。低劣的种曲会导致圆盘制曲的酶活力低，影响原料全氮利用率，酱醪布酱困难，不易出油，导致巨大的经济损失。自动种曲机培养的种曲质量好，劳动强度低，细菌总数显著改善［1，2］。本文以中科3.951米曲霉为菌种，研究了种曲机制曲工艺参数对种曲质量的影响，通过单因素和正交试验优化了种曲机制曲工艺参数，并对比了优化前后种曲对酱油品质的影响，以期为酱油酿造提供优质的种曲。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验仪器

CX31型生物显微镜 日本奥林巴斯有限公司；血球计数板 上海求精生化试剂仪器有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台 苏州净化设备公司；ALKOMAT密度计 奥地利安东帕公司；W2S-185A型雷磁浊度仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；100kg种曲机 千禾味业食品股份有限公司。

1.1.2 试验菌种

3.951 米曲霉：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），冻干管。

1.1.3 斜面培养基

豆汁培养基：大豆常温浸泡12h，加5倍水，小火煮沸1h过滤，调节浓度为5°Bé，加入2%琼脂，分装灭菌，制成斜面。

1.1.4 原料要求

麸皮：水分11%～13%，粗蛋白11%～14%，20目过筛率为40%～45%；酵母抽提物：国家标准GB／T 23530－2009《酵母抽提物》中纯品型［3］；空气为无菌空气，补水为无菌水。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

将冻干菌种3.951无菌操作接入豆汁斜面培养基，30℃培养5天，待斜面长满绿色的孢子，再无菌传代2次，每次培养5天，获得孢子密集的斜面种子。

1.2.2 三角瓶种子的制备

麸皮500g加入水500mL拌匀，搓碎去除团块，润水30min，再次混匀，分装于500mL三角瓶中，每瓶30g，其厚度约为1cm。塞透气硅胶塞子，包扎防潮纸，蒸汽加压灭菌0.1MPa，维持30min。灭菌冷却后，无菌接入2环试管斜面种子，30℃生化培养箱中静置培养。培养17～19h后，曲料表面布满白色菌丝并结块时第1次摇瓶，曲料充分摇散平摊于三角瓶底部。再培养4～6h，菌丝大量生长并结块时第2次摇瓶，再次将曲料充分摇散平摊于三角瓶底部。培养48h后，曲料结块可见大量的孢子时扣瓶，继续培养至72h。

1.2.3 种曲机培养

种曲机投料共计100kg，按照试验设计要求配制原料，其中根据试验设计要求需要使用酵母抽提物的，先按照润水比例取水，再将称量好的酵母抽提物溶于水中，搅拌均匀后润水。曲盘装料，厚薄均匀，厚度约2cm。蒸料温度121℃，20min。降温至30℃时，接入4瓶三角瓶种子，按照试验要求通风和补水，培养72h开罐出曲。种曲机培养种曲工艺流程见图1。

图1 种曲机培养种曲工艺流程Fig.1 The technological process of cultivating seed koji with seed koji machine

1.2.4 试验设计

1.2.4.1 单因素试验

分别针对润水量、风量、补水量和酵母抽提物用量对种曲孢子数的影响进行单因素试验。确定各个影响因素比较适合的范围，为进一步采用统计学方法进行试验优化提供有利的数据参考。润水量单因素试验：设计 70%，80%，90%，100%，110%，120%，130% 共计7个润水梯度，补水量为60L／罐，通风量为1.5m3／h，30℃培养72h；风量单因素试验：设计0.5，1，1.5，2，2.5m3／h 5个风量梯度，按照润水量100%，补水量60L／罐，30℃培养72h；补水量单因素试验：设计20，30，40，50，60，70，80，90L／罐8个补水梯度，按照润水量100%，通风量为1.5m3／h，30 ℃培养72h；酵母抽提物用量单因素试验：设计未添加酵母抽提物和0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%8个梯度，润水量为100%，补水量为60L／罐，通风量为1.5m3／h，30℃培养72h。

1.2.4.2 正交试验

在单因素试验的基础上，选用L16（45）正交设计优化种曲培养条件。4个因素为润水量、风量、补水量和酵母抽提物用量，每个因素设4个水平，同时设置空列。各因素的不同水平见表1。

表1 正交试验L16（45）的因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal test L16（45）

1.2.4.3 验证试验

依照正交试验确定的最佳工艺参数制种曲，对比优化前与正交优化后的孢子数及用于酱油生产的成曲和原油指标，验证正交优化后的工艺参数。

操作要点：5kg大豆浸泡过夜，121℃加压蒸煮30min，降温30℃裹上15%的面粉，接种0.1%种曲，30℃培养45h得到酱油成曲，混入22%的盐水10L，33℃发酵6个月。

1.2.5 数据测定方法

1.2.5.1 孢子数的测定

参照SB／T 10315－1999《孢子数测定法》［4］。

1.2.5.2 酱油理化指标的测定

参照 GB 18186－2000《酿造酱油》［5］。

1.2.5.3 乙醇的测定

相对密度法［6］。

1.2.5.4 浊度的测定

浊度仪测定法［7］，取20mL压榨后的生酱油用浊度仪测定。

1.2.5.5 细菌总数的测定

平板计数琼脂，成曲测定需加入防霉剂杀真菌素50mg／L。

1.2.5.6 中性蛋白酶活的测定

参照SB／T 10317－1999《蛋白酶活力测定法》［8］。

2 结果与分析

2.1 润水量对种曲质量的影响

米曲霉生长需要一定量的水分，接入三角瓶的种子需在原料上吸水膨胀后发芽，然后菌丝大量繁殖，其生长过程需要耗掉大量的水分。所以原料必须有适量的润水，试验设计润水量为70%，80%，90%，100%，110%，120%，130%共计7个润水梯度，补水量为60L／罐，通风量为1.5m3／h，30℃培养72h，润水量对种曲质量的影响见图2。

图2 润水量对孢子数的影响Fig.2 Effect of water moisture on the number of spores

由图2可知，随着润水量的增加，孢子数呈先上升后下降的趋势，证明润水量并不是越高越好，适宜的润水量才适合米曲霉形成丰富的孢子。原料润水为米曲霉生长提供了初始水分，润水量过低，会影响孢子的萌发速度，菌丝变得瘦而短；润水量过多，物料板结，米曲霉菌丝不易长入物料的内部，影响种曲质量。润水量为100%时，物料疏松，料层通氧效果好，利于菌丝繁殖。相对而言，润水量低对种曲质量影响较大，当润水低于80%时，会严重影响种曲的质量。

2.2 风量对种曲质量的影响

米曲霉生长需要耗氧，因此风量会影响米曲霉的生长。试验设计0.5，1，1.5，2，2.5m3／h 5个风量梯度，按照润水量100%，补水量60L／罐，30℃培养72h，风量对种曲质量的影响见图3。

图3 风量对孢子数的影响Fig.3 Effect of air volume on the number of spores

由图3可知，风量为1，1.5，2，2.5m3／h时种曲孢子数差异不大，但随着风量的增加，孢子数降低，主要原因是风量增加，风速过快，会带走物料的水分，从而影响米曲霉的生长。风量低于0.5m3／h时，则不能满足米曲霉生长的耗氧需求，影响米曲霉生长。

2.3 补水量对种曲质量的影响

种曲培养需要72h，培养的过程需要通入无菌压缩空气以满足米曲霉生长的耗氧需求，通风的同时也会带走物料的水分，如不额外补水，会导致物料发干，米曲霉不能正常生长。试验设计20，30，40，50，60，70，80，90L／罐8个补水梯度，按照润水量100%，通风量为1.5m3／h，30℃培养72h，补水量对种曲质量的影响见图4。

图4 补水量对孢子数的影响Fig.4 Effect of water replenishment amount on the number of spores

由图4可知，补水量为50～80L／罐时种曲孢子数变化不大，但随着补水量的增加，孢子数有下降趋势，而补水量过低对孢子数的影响较大。

2.4 酵母抽提物对种曲质量的影响

杜双奎等［9］报道添加硝酸铵为米曲霉生长提供了氮源。杨兰等［10］的研究结果显示，酵母抽提物对酱油种曲生长的促进作用较为明显。酵母抽提物为食品原料，含有多种氨基酸、维生素及矿物质，因此，选择酵母抽提物为种曲促进剂，同时提供一定量的氮源。试验设计未添加酵母抽提物和0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%8个梯度，润水量为100%，补水量为60L／罐，通风量为1.5m3／h，30℃培养72h，酵母抽提物用量对种曲质量的影响见图5。

图5 酵母抽提物用量对孢子数的影响Fig.5 Effect of yeast extract amount on the number of spores

由图5可知，添加了酵母抽提物的种曲，其孢子数明显高于未添加的。用量为2%时孢子数最高，但随着用量的增加，孢子数无明显提高。

2.5 正交试验结果与分析

2.5.1 正交试验结果与极差分析

表2 正交试验结果表Table2 Orthogonal test results table

根据极差R的大小，可以判断因素对试验指标的影响主次顺序，由表2可知，极差值R由大到小依次为B＞C＞D＞A，因此，风量对种曲质量的影响最大，补水量和酵母抽提物的用量次之，润水量的影响相对较小。由k值的大小可判断A、B、C、D各水平对本试验指标的影响程度。优化后的组合为A3B3C3D4，即润水量110%，风量2m3／h，补水量70L／罐，酵母抽提物用量2.5%，经无菌种曲机培养72h后的种曲质量最好。

2.5.2 正交试验方差分析

表3 正交试验方差分析表Table3 Variance analysis table of orthogonal test

由表3可知，因素B有极显著性差异，因素C和D有显著性差异，说明风量对种曲孢子数影响最大，补水量和酵母抽提物用量对种曲孢子数也有较大影响。因素A无显著性差异，说明润水量对种曲孢子数无显著性影响。

2.6 验证试验结果与分析

2.6.1 种曲质量对比

优化后的工艺参数：润水量110%，风量2m3／h，补水量70L／罐，酵母抽提物用量2.5%制种曲质量有较显著提高，孢子数平均值由优化前的89.3亿个／g（干基）提升到107.7亿个／g（干基），提高了20.6%，进一步证明优化后的培养条件可以提高种曲质量。

2.6.2 酱油生产对比

将优化前与优化后的种曲用于圆盘制曲，成曲质量对比见表4。

表4 优化前后成曲质量对比Table4 Comparison of the finished koji quality before and after optimization

由表4可知，优化后的种曲用于圆盘制曲成曲细菌总数明显降低，中性蛋白酶活略有提高，优化前的成曲略有氨味和酸味。孢子数较低的种曲圆盘制曲时，不能很好抑制杂菌生长，成曲中芽孢杆菌类增殖过多会导致成曲带有氨味，而其他乳酸菌、微球菌等会导致成曲带有酸味。优化前后酱油质量对比见表5。

表5 优化前后酱油质量对比Table5 Comparison of soy sauce quality before and after optimization

由表5可知，优化后的酱油浊度明显降低，导致酱油浑浊的原因除原料中未分解的大分子物质外，另一个重要原因就是细菌性浑浊，比较优化前和优化后的酱油，生酱油中的细菌总数降低1个数量级。由于产酸细菌的减少，优化后的生酱油的总酸低于优化前的生酱油，氨基酸态氮、全氮均有提高。

3 小结

种曲机制曲工艺参数对种曲质量有较大影响，其中风量和补水量对种曲质量影响较大，而润水量次之，酵母抽提物用量影响相对较小。米曲霉3.951用无菌种曲机培养的优化条件为：润水量110%，通入风量2m3／h，补水量70L／罐，酵母抽提物用量2.5%。优化后种曲的孢子数可达100亿个／g（以干基计）以上，用于圆盘制曲，成曲杂菌数降低，经发酵后的酱油品质较优化前有大幅提升。