17α-乙炔雌二醇诱导胆汁淤积性肝损伤大鼠模型评价

张程亮， 杨金玉， 向 东， 贺雯茜， 刘雅楠， 张 思， 刘 东

华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部，湖北 武汉 430030

肝内胆汁淤积(intrahepatic cholestasis，IC)是由多种因素(感染、免疫、药物、激素、遗传)引起的肝细胞和(或)毛细胆管中胆汁生成和排泄障碍，使得肝内胆汁淤积，血液中胆汁成分增多，从而诱发肝脏炎症和细胞损伤[1]。研究发现，雌激素水平升高是导致妊娠期IC发生的重要因素，长期口服避孕药和使用雌激素替代疗法的患者也容易表现出皮肤黄染、瘙痒等IC的症状和病理特征[2]。对于雌激素诱导的IC发病机制和药物治疗的研究一直是消化领域的热点。

采用合适的动物模型是开展IC发病机理和治疗研究的前提。雌激素诱导的IC是目前研究IC常用的实验动物模型之一，主要采用的雌激素类型有17α-乙炔雌二醇(17α-ethynylestradiol，EE)[3]、雌二醇17β-D-葡萄糖苷酸(estrodiol-17β-D-glucuronide，E17G)[4]、苯甲酸雌二醇(EB)[5]。其中国外多采用E17G，但其价格非常昂贵，国内使用EB较多，然而该药诱导的IC模型在国际上尚未被认可。雌二醇酯类口服均无效，在雌二醇化学结构的17位引入α-乙炔基，使17β-羟基稳定不易被代谢，得到半合成强效雌激素炔雌醇，是口服避孕药的主要组成成分[6]，也是近年来诱导IC动物模型较为关注的造模药物[7]。迄今为止，国内外有关EE诱导在不同给药周期所致胆汁淤积性肝损伤的方面尚缺乏动态观察和检测。如能全面评价并明确EE在诱导胆汁淤积性肝损伤中的最佳给药周期，对于基于该模型的其他科学研究具有重要参考价值。因而，本实验采用SD大鼠连续给予5 mg/kg EE，通过比较不同造模周期大鼠肝损伤的特征和严重程度，最终明确该动物模型的EE最佳给药周期。

1 材料与方法

1.1实验动物雄性SD大鼠36只，体质量(200±20)g，由华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物中心提供，室温保持(25±2)℃，实验前适应性喂养1周，自由摄食与饮水。

1.2主要试剂与仪器EE购自美国Sigma-Aldrich公司(纯度≥98%，批号：C009-2)；戊巴比妥钠购自德国Merk公司(批号：6218-7986)；血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、总胆汁酸(TBA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；酶标仪(型号15052715)购自Bio Tek公司；天平(型号ME104E/02)购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；医用光学显微镜(OLYMPUS，JAPAN)。

1.3动物处理与样本采集将大鼠随机分为6组，每组6只，其中设置只皮下注射丙二醇注射的对照组，另外5组大鼠分别连续每日皮下注射(sc)EE丙二醇溶液2 d、5 d、8 d、12 d、16 d，剂量为5 mg/kg。动物每日称重，按照造模周期分批处死，处死前均禁食不禁水过夜。动物以戊巴比妥钠(1.5 mg/kg)腹腔注射麻醉并固定，心脏采血，4 ℃静置1 h，3 000 r/min(离心半径为3 cm)离心10 min，分离血清，置于-80 ℃冷冻，用于测定血清生化指标；肝脏经门静脉灌洗后，取出肝脏组织，无菌生理盐水冲洗，观察大鼠肝脏外观，并称重计算肝指数：肝指数=肝质量/体质量。采用无菌生理盐水冲洗肝脏，取相同部位肝组织浸于10倍体积的质量浓度为100 g/L的中性甲醛液中，行HE染色。

1.4血清生化指标检测冷冻血清从-80 ℃低温冰箱中取出后，室温放置30～60 min，严格按照试剂盒说明书进行血清中TBA、ALT、AST、AKP含量的测定。

2 结果

2.1一般情况各组大鼠皮下注射EE后，随着造模时间的延长，逐渐出现毛色发黄，且凌乱无光泽，体质量增长缓慢并出现厌食少动的行为学改变。

动物处死后可见，对照组大鼠肝脏柔润，色泽均匀；EE连续注射2 d、5 d、8 d、12 d、16 d的大鼠随时间延长肝脏逐步变大，肝脏表面局部出现泛白并散在小颗粒。造模不同天数肝脏外观形态如图1所示。EE所致肝脏增大和形态学改变主要从5 d开始，5 d之后的肝脏形态变化不显著。

2.2各组大鼠肝指数比较造模期间每日称重，在动物处死后进行肝脏称重并计算肝指数，结果见图2。随着EE注射时间的延长，肝指数逐步增加，从造模5 d之后的各组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。然而，5 d之后各组之间的肝指数差异无统计学意义(P>0.05)，表明造模给予雌激素5 d后肝指数升至平台期。

2.3各组大鼠肝脏组织病理学观察肝脏组织HE染色结果如图3所示，对照组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞结构清晰且排列整齐，肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射性排列，肝细胞无变性与坏死；给予EE连续注射2 d，大鼠肝细胞呈现轻微水肿，部分细胞核固缩，排列紊乱，肝细胞索结构不明显；持续注射EE 5 d 后，可见大鼠肝小叶中央静脉区肝细胞索消失，肝细胞排列紊乱，水肿更加明显，部分区域出现肝细胞空泡样变性坏死与炎性浸润。持续注射EE 8 d、12 d、16 d 时的大鼠肝脏病理学变化与造模5 d时相似。

2.4各组大鼠血清生化指标比较大鼠血清生化指标如ALT、AST、AKP和TBA等是反映肝脏损伤和胆汁淤积程度的经典指标。与对照组相比，在造模2 d时，AKP和TBA显著升高，而ALT活性和AST在造模5 d时才显著升高(P<0.05)。如图4所示，上述指标在5 d时达到最大值，随着EE给药周期的延长，其变化与5 d时相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 不同周期EE造模大鼠的肝脏形态学Fig 1 Hepatic morphology of EE-induced cholestasis rats with different dosing cycles

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图2 EE诱导IC大鼠肝指数变化Fig 2 Changes of liver index in IC rats induced by EE

3 讨论

大量研究已经表明，雌激素类物质可在人类和啮齿类动物中诱发可逆性的IC。1954年首次报道了妊娠期胆汁淤积症后，人们在上世纪60年代后又发现口服避孕药也可引发IC，因此，雌激素诱导IC的临床和基础研究至今仍吸引着医学科学家们的兴趣和热情[8]。研究发现，EE通过自身作用或与雌激素受体结合，使肝细胞胆管膜上的外排转运体活性下降，基底膜的摄取转运体的表达也受到抑制，从而造成机体胆汁酸稳态的破坏，并伴随炎症、氧化损伤和肝细胞损伤等病理学现象，这与人类IC的发病过程和机制较为相似[9-10]。此外，雌激素导致胆汁淤积性肝损伤的机制还与其引起胆汁酸的合成障碍有关[11]。

在EE诱导的动物模型中，雄性或雌性动物均有应用。一般来讲，如果需要特定地研究妊娠期胆汁淤积，则需要在雌性孕鼠中进行造模。雌性动物在实际操作中相对复杂，需要在怀孕动物体内注射雌激素，受到实验动物生理周期和受孕时间不一致的影响，在实验的同步性操作方面存在困难。如果宽泛地研究雌激素诱导各种IC，则更多会选取雄性动物进行造模和评价[12-13]。

尽管已有部分文献进行了EE诱导动物IC的研究，但对于EE不同造模周期造成胆汁淤积性肝损伤的严重程度在国内外尚未见文献报道。在本研究中，我们采用国际上通用5 mg/kg剂量的EE诱导大鼠胆汁淤积模型。研究发现，在不同时间给药诱导后，动物逐渐出现毛发黄染、精神、饮食和自主活动较差的现象，肝指数显著增加，肝脏和肠道病理学表现出明显的结构紊乱、细胞损伤、坏死、炎性浸润等现象。以上结果表明，我们采用EE成功诱导胆汁淤积性肝损伤动物模型，相应的形态和病理学改变与文献报道一致[12，14]。然而，上述病理学改变从造模出现、逐步加重、到5 d后维持稳定的形态学和病理学损伤特征，并未出现随着给药时间延长而加重的现象。

血清生化指标可以定量反映肝细胞损伤程度和病理类型。TBA是胆固醇在肝脏分解及肠-肝循环中的一组胆汁酸代谢产物，与胆固醇的吸收、代谢及调节关系密切，可同时反映胆汁的合成、分泌情况和肝细胞损伤状态[15]。AKP表达于肝细胞和胆管细胞的顶端，并大量分泌于胆汁中，在胆汁淤积状态下血清AKP会显著升高[16]。因此，AKP和TBA是反映胆汁淤积性肝损伤程度的标准血清标志物，往往在肝脏胆汁淤积的早期即开始升高[17-18]。ALT和AST在正常情况下存在于肝细胞的胞浆和线粒体内，当肝细胞受损时，ALT和AST释放到血液中，故ALT和AST是肝损伤的诊断标准之一[19]。我们发现EE诱导的胆汁淤积大鼠血清中上述生化指标在造模2 d时开始均出现升高现象，其中以TBA和AKP的升高最为明显，而所有检测生化指标在5 d时达到最大值。结合上述病理学改变的时间特征，本研究发现EE诱导胆汁淤积性肝损伤的病理破坏与胆管结扎引起的肝外胆汁淤积所表现的进行性严重破坏不同[20]，其损伤程度相对肝外胆汁淤积较轻，同时也不会随给药周期延长而逐步加重。我们推测EE诱导的胆汁淤积性肝损伤由于不存在机械性胆管梗阻和狭窄的现象，可能在5 d后机体尤其是肝脏进行代偿性改变而适应性调整，从而不会出现肝损伤进行性加重的现象。

图3 EE诱导IC大鼠肝脏病理切片(HE 200×)Fig 3 Liver pathological section in EE-induced cholestasis in rats (HE 200×)

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01。图4 大鼠血清生化指标检测结果(n=6)

综上所述，本文采用国际通用的5 mg/kg EE成功诱导了胆汁淤积性肝损伤大鼠模型，且评价了不同造模周期对于大鼠肝损伤程度的影响，根据本文的研究结果，我们认为EE诱导胆汁淤积性肝损伤的造模周期以连续皮下注射5 d较佳。这一模型可以用于雌激素诱导IC的病理学和药物干预研究。