流式样本保存时间对肝癌患者外周血T淋巴细胞和NK细胞的影响

代艳超，覃 岭，高梦丹，孙坚萍，张永宏

首都医科大学附属北京佑安医院生物医学信息中心，北京 100069

流式细胞仪已经成为临床及科研工作中不可或缺的工具，在免疫研究、免疫性疾病检测和预后的判断中均有重要意义[1-5]。目前提出使用新鲜的外周血进行流式细胞检测，从而保证检测结果的准确性及表型检测的可靠性，但是，由于流式细胞仪价格昂贵，并不是所有实验室可以独立拥有一台进行立即上机检测，因此，流式细胞仪检测处理样本保存多长时间可以保证其细胞及亚群的百分比结果稳定，是一个亟待解决的问题。之前有研究关注艾滋病、白血病、肺癌等疾病患者,健康者样本的保存时间和温度对流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群的影响[6-8]，而对肝癌患者外周血样本的T细胞亚群及NK细胞的研究未见报道。因此，本文将对肝癌患者外周血样本预处理后保存时间对流式细胞仪检测T淋巴细胞及NK细胞的影响进行研究。

1 资料与方法

1.1一般资料随机收集北京佑安医院肝癌患者16例，男7例，女9例；年龄(44±11.32)岁(27～59岁)。所有患者均自愿签署知情同意书。

1.2仪器与试剂真空采血管为BD真空采血管，内含EDTA-K2抗凝剂。淋巴细胞亚群：使用BD公司和Ebiolegned公司的抗体及BD公司鞘液进行检测。抗体及标记荧光素分别为：CD3 AF700(Ebiolegend公司)，CD4 FITC(BD公司)，CD8 APC-H7(BD公司)，CD56 PE-CF594(BD公司)。仪器使用BD LSRFortessa高端科研型流式细胞仪。血常规及生化检测为本院常规检测结果。

1.3方法

1.3.1 外周血单个核细胞分离：采集患者外周血10 ml，6 h内分离外周血单个核细胞。将真空采血管2 200 r/min离心7 min，收集血浆；用RPMI 1640培养基稀释，混匀，缓缓加入到带有淋巴细胞分离液的离心管中，931×g离心20 min，提取淋巴细胞层细胞；RPMI 1640培养基洗涤细胞，计数。部分细胞用于流式细胞仪检测，其余细胞冻存。

1.3.2 流式细胞仪检测样本的处理：16例肝癌患者样本分离后的外周血单个核细胞各取2.5×107细胞，分为5个组，每组为0.5×107细胞，均同时进行CD3 AF700、CD4 FITC、CD8 APC-H7、CD56 PE-CF594染色。五组分别为：立即上机组；加入PBS，4 ℃保存1 d组；加入PBS，4 ℃保存2 d组；加入PBS，4 ℃保存3 d组；加入PBS，4 ℃保存5 d组。

1.4统计学方法采用Graphpad Prism6软件对数据进行处理和分析，对于计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1外周血常规及生化指标检测15例肝癌患者(1例数据缺失)外周血血常规检测结果：白细胞计数(5.32±0.61)×109L-1，淋巴细胞绝对值(1.43±0.21)×109L-1，单核细胞绝对值(0.44±0.09)×109L-1，中性粒细胞绝对值(3.57±10.51)×109L-1，均在参考值范围内。13例肝癌患者(3例数据缺失)外周血生化检测结果：ALT水平为(94.45±53.06)U/L；AST水平为(115±75.01)U/L，均高于参考值范围。

2.2不同保存时间上机淋巴细胞物理参数变化情况样本处理后立即上机、保存1 d、2 d、3 d和5 d后上机，细胞物理参数变化情况结果显示：样本处理后立即上机、保存1 d和2 d，淋巴细胞分群明显(见图1，红、蓝、橘红色线条)，而保存3 d和5 d，淋巴细胞分群不明显，前向角和侧向角位置与处理后立即上机、保存1 d和2 d比较发生了较大变化(见图1，荧光绿和草绿色)，可见，样本保存3 d后，淋巴细胞的物理参数发生变化。

图1 不同保存时间淋巴细胞物理参数的变化情况Fig 1 The changes of physical parameters of lymphocyte in different storage times

2.3不同保存时间检测CD3+T细胞比例及其亚群百分比样本处理后立即上机、保存1 d、2 d、3 d和5 d CD3+T细胞比例结果显示，立即上机组CD3+T细胞比例为(54.62±6.013)%，保存1 d组CD3+T细胞百分比为(54.81±4.357)%，保存2 d组CD3+T细胞比例为(54.33±5.276)%，保存3 d组为(38.04±4.511)%，保存5 d组为(27.29±4.352)%，可见，到第3天时，CD3+T细胞比例显著降低(P<0.05，见图2A)。

比较观察处理后立即上机、保存1 d和2 d CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值及NKT(CD3+CD56+T)细胞间的差异，结果显示，CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD8+T细胞比值及NKT细胞，立即上机、保存1 d、2 d组间差异无统计学意义(P>0.05，见图2B～2E)。

2.4不同保存时间上机检测NK细胞结果比较样本处理后立即上机、保存1 d、2 d、3 d、5 d后上机NK细胞(CD3-CD56+)比例。结果显示，立即上机组NK细胞比例为(27.06±5.61)%，保存1 d组NK细胞比例为(26.29±4.72)%，保存2 d组NK细胞比例为(27.35±5.38)%，保存3 d组为(14.89±3.45)%，保存5 d组为(10.21±2.95)%，保存3 d组和5 d组NK细胞比例显著降低(P<0.05，见图3)。

图2 不同上机时间对CD3+T细胞比例及其亚群百分比比较情况 A: CD3+T细胞； B： CD3+CD8+T细胞；C： CD3+CD4+T细胞；D： CD4+/CD8+T； E： CD3+CD56+T细胞Fig 2 Comparison of the percentage of CD3+T and its subsets in different storage time A: CD3+T cells； B： CD3+CD8+T cells；C： CD3+CD4+T cells；D： CD4+/CD8+T； E： CD3+CD56+T cells

图3 不同保存时间NK细胞百分比比较Fig 3 Comparison of the percentage of NK cells in different storage times

3 讨论

流式细胞检测可以比较细胞的相对大小和胞内的复杂程度，前向角散射(FSC)对应的是细胞的相对大小，FSC的值越大表示细胞越大；侧向角散射(SSC)对应的是细胞内部复杂程度，SSC的值越大说明细胞内部的颗粒越多。本研究在确定电压等检测条件后，在不改变检测条件的前提下，对立即上机、保存1 d、2 d、3 d和5 d的细胞分别进行检测，观察FSC和SSC的变化情况，结果发现立即上机、保存1 d和2 d的FSC位置基本没有变化；保存3 d和5 d的FSC发生左移。将两图叠加在一起可以很明显地观察出对于肝癌患者的外周血单个核细胞，随着保存时间的延长，细胞逐渐缩小。EKONG等[7]提出患者于健康人相比，在机体状态异常的条件下，长时间储存样本对其细胞物理参数和化学参数的影响可能更为明显。

流式检测结果发现，样本保存3 d组CD3+T淋巴细胞显著减少，提示如果进行淋巴细胞的相关检测，样本处理后用PBS在4 ℃条件下最多保存2 d。淋巴细胞亚群包括CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+与CD3+CD8+细胞百分比比值在立即上机组、保存1 d和保存2 d组间差异无统计学意义，虽然CD3+CD56+T(NKT)细胞的比例可以看出随保存时间的延长而降低，但差异无统计学意义。本研究只对立即上机组、保存1 d和2 d组的细胞进行了细胞亚群分析，是因为对细胞进行活死染色后，发现保存3 d组细胞显著发生死亡，因此无法对保存3 d的淋巴细胞亚群进行比较。在陈潇等[6]的研究中发现保存3 d的样本，CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴细胞亚群检测结果与采集后1 h内检测结果差异无统计学意义；但是在方芳等[8]和EKONG等[7]的研究中发现，保存72 h后淋巴细胞亚群等各项差异有统计学意义。

本研究进一步对样本处理后立即上机组、保存1 d、2 d、3 d、5 d组的CD3-CD56+(NK)细胞比例进行比较，结果发现保存3 d组NK细胞比例显著降低。方芳等[8]对非肝癌患者样本外周血在采集后6 h内检测、保存24 h和36 h的CD56+CD16+比例进行比较，发现差异无统计学意义。本研究延长了保存时间进行检测，结果提示如果对NK细胞进行流式检测，样本处理后，用PBS在4 ℃保存48 h内进行检测结果均稳定。

综上所述，临床样本在收到后进行处理，用PBS于4 ℃条件下保存3 d内进行T淋巴细胞和NK细胞的上机检测结果比较稳定。此研究结果一方面可以为需要预约流式细胞仪的研究人员提供一个流式样本保存条件的依据；另一方面可以减少流式细胞仪的开机次数，减少仪器损耗，节约资源和成本。