青海省6种高寒禾本科牧草的耐盐性

李京蓉，马 真，刘泽华，乔安海，邓艳芳，王文颖，姚步青,，杨正荣，张春辉，周华坤,

（1. 中国科学院西北高原生物研究所 / 青海省寒区恢复生态学重点实验室，青海 西宁 810001；2. 青海师范大学，青海 西宁 810008；3. 青海省草原总站，青海 西宁 810001；4. 青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海 西宁810016；5. 青海省铁卜加草原改良试验站，青海 铁卜加 813000）

在全球范围内，盐是限制植被产量和品质的最重要的环境因素之一[1-2]。盐碱化是当今世界荒漠化和耕地退化的主要原因之一，这也引起了科研人员对植物盐碱抗性生理和生态的关注和研究[3]。在干旱半干旱地区，降水量少、蒸发量大、用水量不合理等因素是造成盐胁迫的重要原因[4]。盐胁迫环境通过影响作物生长发育而影响作物的产量[5]。青海省地处中国西北地区，干旱、半干旱、大面积的盐碱地是制约当地农业和畜牧业发展的主要因素[6]。如何合理有效地利用和改善盐碱地，对促进青海地区的农业和畜牧业发展具有积极意义。

青海省高寒草甸的禾本科牧草具有良好的适应性和耐盐性[7]，可以用于改善盐碱地。禾本科牧草的耐盐性通常优于豆科牧草和普通作物[8]。在盐胁迫条件下植物种子能否正常发芽及生长是植物生长发育及能否建植成功的先决条件[9-10]。因此，对盐胁迫条件下禾本科牧草种子萌发和幼苗生长的研究具有重要意义。本研究所选6种牧草均属禾本科多年生牧草，多分布于海拔高度3 000-4 300 m的天然草地，是改善干旱、盐碱草地和栽培草地建植的优良草种，也是退化草地恢复和水土保持的重要草种[11]。但目前处于试验阶段，并未在生产建设中大规模使用。本研究对盐胁迫条件下6种禾本科牧草萌发期和苗期的各指标变化情况进行分析，通过隶属函数综合评价供试禾本科牧草耐盐能力的强弱，旨在对牧草耐盐鉴定、耐盐性新品种的选育和应用及盐碱地的改良利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本研究选取了6种在青海省分布较为广泛的禾本科牧草进行抗盐性评价，详情如表1所列。

表1 供试材料Table 1 Test materials

1.2 试验方法

1.2.1 牧草萌发期试验

种子处理：选择成熟、饱满、中等大小、均匀、无病的健康种子于1% NaCl溶液中浸泡15 min，然后用蒸馏水冲洗3遍并放置在铺有3层滤纸的培养皿中，加入适量的NaCl溶液(浓度分别为 70、140 和 280 mmol·L-1)，对照 (CK)加入蒸馏水。培养皿放置于培养箱，温度控制在20 ℃，每天光照12 h，每天加入相同体积的NaCl溶液，对照加蒸馏水，每4 d更换滤纸以使水势的变化最小化。每个处理(包括CK)设4个重复，每个重复选用50粒种子。自种子置于培养箱中开始观察，以胚芽长度等于发芽种子1/2的长度为标准。将重复中最早有1粒发芽的日期作为开始，此后每天记录发芽种子的数量，当连续15 d不再有种子发芽时作为发芽结束期[12-14]，并按下式计算。

发芽率 = (正常发芽种子数/供试种子数) × 100%。

1.2.2 牧草苗期试验方法

选择土壤进行筛分，除去石头及杂质，将沙∶有机肥∶土按1∶1∶4的混合基质置于塑料花盆中，用清水浇透，在花盆中均匀撒下消毒后的种子，用干土轻轻覆盖，播种深度为1 cm。播种后，幼苗长至2～3片叶时进行间苗，每盆留30株。6种牧草每种5盆，共30盆。待生长到4～5片叶时进行NaCl处理。NaCl处理浓度分别为 50 、100 、150、200 mmol·L-1，对照用蒸馏水，每个处理4次重复。在NaCl处理前3 d对所有牧草进行浇水处理，使每盆土壤处于饱和含水状态(土壤含水量保持在 22.8% ± 2.0%)。NaCl处理采用浓度梯度递升的方式依次进行处理，14 d后分别对各生理指标进行测定。

1.3 牧草苗期生理指标测定及方法

1.3.1 丙二醛 (MDA)含量

将试验材料磨成浆液于离心管中，离心10 min，上清液为萃取物，取上清液测其体积。在提取液中加入 2 mL 0.3% TBA 溶液，沸水浴中 15 min 后立即冷却，再次离心15 min，取上清液，测定450、532、600 nm 波长的吸光度。根据 CMDA= 6.45(D532－D600) － 0.56D450，计算出MDA的浓度，再按下式得出MDA的含量[15-16]。

MDA 含量 = (MDA 浓度 × 提取液体积)/植物组织鲜重。

1.3.2 叶绿素相对含量

称取剪碎的鲜样0.3 g，于研钵中研磨成匀浆，加80%丙酮，继续磨至组织变白，再过滤至25 mL容量瓶中，反复用丙酮清洗数次，最后用丙酮定容至25 mL。以80%丙酮为空白对照，测定470、646、663 nm波长下的吸光值。

Ca＝ 12.21D663－ 2.81D646；

Cb= 20.13D646－ 5.03D663；

叶绿素总浓度 C ＝ Ca＋ Cb；

Cx.c= (1 000D470－ 3.27Da－ 104Cb) / 229；

式中：Ca、Cb分别表示叶绿素a和叶绿素b的浓度；Cx.c表示类胡萝卜素的总浓度。

根据下式计算组织中各色素的含量：

色素含量 = (色素浓度 C × 提取液总量 × 稀释倍数 × 1 000) / 样品叶片鲜重。

1.3.3 可溶性糖含量

将样品置于试管中并封口，在沸水中提取30 min，冷却后吸取0.5 mL提取液于加有1.5 mL蒸馏水的试管中，并依次加入0.5 mL的蒽酮乙酸乙酯和5 mL浓硫酸充分振荡，逐管立即准确保温1 min，蒸馏水作对照，测定其在630 nm波长下的吸光度值。

可溶性糖含量 = (C × V/a) / W；

式中：C为葡萄糖量，由标准曲线求得(μg)；V是提取液总体积(mL)；a为测定时所吸取的体积(mL)；W为样品重(g)。

1.3.4 游离脯氨酸含量

用3%的磺基水杨酸在沸水浴中提取15 min后，用酸性茚三酮法显色，然后用甲醛萃取，避光静置4 h后，吸取甲苯层在520 nm波长下测定吸光度[1]。

脯氨酸 = (C × V/a) / W；

式中：C为四氮唑还原量(mg)，由标准曲线求得；V为提取液总体积(mL)；a为测定时所吸取的体积(mL)；W为样品重(g)。

1.4 数据处理与分析

试验所得数据通过 Microsoft Excel 2007 进行处理并作图；用SPSS 20.0统计软件对相同物种不同浓度间，以及相同浓度不同物种间的各项生理指标；用Student-Newman-Keuls方法进行在0.05显著水平上的多重比较；用Origin制图软件制作插图。

2 结果与分析

2.1 NaCl处理对6种禾本科牧草萌发期影响

草原看麦娘种子( Alopecurus pratensis)的萌发率在每个浓度梯度均显著高于其余5种牧草(P ＜0.05)(图 1)，除 NaCl浓度 280 mmol·L-1，扁穗冰草(Agropyron cristatum) 萌发率和其余 5 种牧草均存在显著差异。而不同浓度NaCl同一物种间除扁穗冰草在 NaCl浓度 140和 280 mmol·L-1差异不显著外，其余均存在显著差异(P＜0.05)，且随浓度的增大萌发率显著下降。

2.2 NaCl处理对6种禾本科牧草苗期各生理指标影响

2.2.1 6种禾本科牧草丙二醛含量的变化

图1 不同NaCl浓度处理下6种牧草的萌发率Figure 1 Germination rate of 6 pastures under different NaCl concentrations

表2 不同NaCl浓度处理下6种牧草丙二醛含量Table 2 MDA content of six grass species under NaCl treatment μmol·g-1

随着NaCl胁迫强度的增加，各牧草叶片中的MDA含量均显著升高 (P＜0.05)(表 2)。NaCl浓度在 0～100 mmol·L-1时牧草叶片中 MDA 含量变化幅度较小，说明牧草幼苗对低浓度NaCl胁迫有一定耐受能力；随着NaCl胁迫的加剧，在150和200 mmol·L-1的NaCl浓度下，扁穗冰草和同德贫花鹅观草(Roe gneria pauciflora Tongde)的 MDA含量增加较多，分别是对照的9.14、12.31倍和7.84、11.81倍；增加较少的是草原看麦娘和无芒雀麦，分别是对照的5.72、8.54倍和5.84、8.14倍。这表明扁穗冰草、同德贫花鹅观草受到的伤害较大，草原看麦娘、无芒雀麦受到的伤害则较小。

2.2.2 6种禾本科牧草叶绿素含量的变化

随着NaCl浓度的增大，6种禾本科牧草的叶绿素含量呈现先升后降的变化，同一物种在不同NaCl浓度下的叶绿素含量差异显著 (P＜0.05)(表 3)。NaCl浓度为 50 mmol·L-1时，所有牧草的叶绿素含量均最高；NaCl浓度为 200 mmol·L-1时，所有牧草叶绿素含量较对照均显著下降(P＜0.05)，同德贫花鹅观草下降的最多，较对照下降了84.5%，叶绿素含量最少，受NaCl胁迫伤害大；而草原看麦娘下降最少，较对照下降了49.4%，受NaCl胁迫伤害小；同德短芒披碱草和大颖草分别下降了60.7%和59.5%，耐盐性居中间。

2.2.3 6种禾本科牧草可溶性糖含量的变化

6种禾本科牧草的可溶性糖含量呈先增加后降低的趋势 (表 4)，NaCl浓度为 100 mmol·L-1时，所有牧草的可溶性糖含量均最高，150～200 mmol·L-1时可溶性糖含量下降，200 mmol·L-1时的可溶性糖含量最低。同一浓度下6种禾本科牧草间可溶性糖均值比较，无芒雀麦可溶性糖含量最高，显著高于其他所有牧草(P＜0.05)；其次是草原看麦娘；同德贫花鹅观草和扁穗冰草之间、同德短芒披碱草和大颖草之间差异不显著(P ＞ 0.05)，但后两种显著高于前两种牧草。

表3 NaCl处理下6种牧草叶绿素含量的变化Table 3 Changes of chlorophyll content of six grass species under NaCl treatment μg·g-1

表4 NaCl处理下 6 种牧草可溶性糖含量的变化Table 4 Changes of soluble sugar content of six grass species under NaCl treatment mmol·g-1

2.2.4 6种禾本科牧草脯氨酸含量的变化

随着NaCl浓度的增加，6种禾本科牧草叶片中的脯氨酸含量也显著增加(P＜0.05)(表5)。同一浓度不同物种间的脯氨酸均值，大颖草、扁穗冰草和同德短芒披碱草之间、草原看麦娘和无芒雀麦之间差异不显著(P ＞ 0.05)，但后两种显著高于前3种。

2.2.5 6种禾本科牧草耐盐性综合评价

将参试的6种禾本科牧草与抗盐性有关指标进行综合分析，计算不同材料各指标隶属度值，并以各材料的平均抗盐隶属度作为耐盐鉴定综合评价指标。结果显示，6种牧草的耐盐性强弱表现为，无芒雀麦＞草原看麦娘＞大颖草＞同德短芒披碱草＞扁穗冰草＞同德贫花鹅观草(表6)。

3 讨论

影响植物种子萌发和幼苗生长的重要因素是盐[3]。罗志娜等[17]通过对燕麦(Avena sativa)种子的耐盐性的研究，得出随盐胁迫的加剧，低盐对种子萌发的影响极小，高盐则对种子萌发的抑制作用很强[18]。也有研究[19]指出，盐胁迫的浓度达到一定值时，增加的盐浓度对植物的种子萌发和幼苗生长形成抑制效应。史燕山等[20]的研究表明，在低盐下某些植物种子的萌发率显著高于对照，而高盐胁迫下，种子的萌发率显著降低。本研究中只有扁穗冰草在 70 mmol·L-1浓度的 NaCl处理下种子的萌发率有一点升高，其他牧草相比对照呈下降趋势，因此，高盐胁迫对种子萌发有明显的抑制作用，其抑制程度不同是由于不同物种对盐的耐性不同所致。

表5 NaCl处理下 6 种牧草脯氨酸含量的变化Table 5 Changes of proline content of six grass species under NaCl treatment μg·g-1

表6 各牧草对NaCl处理适应指标的隶属函数值及评价Table 6 Membership value and evaluation of adaptation indexes of herbage to NaCl treatment

MDA和脯氨酸是抗盐胁迫的重要抗氧化剂。受盐胁迫的牧草通过增加渗透调节物的含量，来维持正常的生理代谢，从而增加对盐的抗性[21-22]。在本研究中，当NaCl浓度较低时，牧草能抵抗胁迫，但不同的牧草对盐胁迫的敏感度不一样，NaCl浓度的增加会破坏或伤害牧草的膜结构和功能，导致膜通透性增大，渗透调节物外渗，脂质化增强，影响幼苗生长。因此，牧草中MDA和脯氨酸的增加是牧草对盐的耐受性增强的表现。本研究结果表明，扁穗冰草、同德贫花鹅观草受盐胁迫的伤害最大，草原看麦娘、无芒雀麦受盐胁迫的伤害则最小，大颖草、同德短芒披碱草受盐胁迫的伤害居中。

叶绿素不仅能吸收和传递光能，还是光合作用必不可少的原料，是植物光合能力的重要指标。在盐碱胁迫下，叶片细胞的叶绿体结构被破坏，叶绿素含量在一定程度上降低并影响光合作用。大多数对于不同NaCl浓度对叶绿素含量的影响的研究发现NaCl胁迫显著降低牧草中的叶绿素含量[23-25]。在本研究中，随着NaCl浓度的增加，6种牧草的叶绿素含量先增加后降低，同一物种的叶绿素含量有显著差异(P＜0.05)，呈现出低NaCl浓度处理促进叶绿素的合成，高NaCl浓度则抑制其合成，这与之前的研究一致[26]。这是因为盐胁迫下高浓度的盐分破坏细胞内的色素-蛋白-脂质复合体，降低叶绿素a和其他色素的含量，所以随NaCl浓度的增加，呈现先增后减的趋势。

可溶性糖是植物细胞的主要有机渗透调节因子，它直接反映了细胞遭受伤害的程度，其总含量也决定了植物对盐胁迫的抗性[26]。本研究表明可溶性糖含量在 NaCl浓度为 100 mmol·L-1时最高，在 150～200 mmol·L-1下降，表明低盐浓度促进牧草渗透调节力，而高盐浓度已经使牧草受到盐害。NaCl浓度为100 mmol·L-1也可作为本研究材料盐胁迫的临界值，可以为实践应用提供理论依据。

本研究在室内对6种禾本科牧草做了盐胁迫试验，但还有待于到实际生态环境中去检验。在今后的研究中，建议能与实际环境条件和生产实际有机结合，则能更完整地说明6种牧草的抗盐性，以及对不同NaCl浓度梯度的响应，从而选出真正需要的抗盐型高寒牧草。

4 结论

本研究运用隶属函数对6种禾本科牧草种子萌发及幼苗的耐盐性进行综合评价分析，得出各供试材料的耐盐性强弱表现为无芒雀麦＞草原看麦娘＞ 大颖草＞同德短芒披碱草＞扁穗冰草＞同德贫花鹅观草。