TCP抑制LSD1对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

王战士， 杨小荣，任黎刚，张心男，孙 庭

(1.浙江省立同德医院 泌尿外科， 浙江 杭州 310012；2.南昌大学第一附属医院 泌尿外科，江西 南昌330006)

肾癌(renal carcinoma)是泌尿系统常见的恶性肿瘤，其主要病理类型为肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)，发病率约占肾癌的85%[1-2]。目前肾癌的主要治疗方法是外科手术切除，但转移性肾癌预后较差，且对放化疗等治疗不敏感，5年存活率低于5%[3]。分子靶向药物(如舒尼替尼等)已广泛用于晚期转移性肾透明细胞癌，然而药物的不良反应及高昂医疗费用限制了其临床应用。表观遗传调节异常是肿瘤发生(包括ccRCC)的重要机制[4]。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1, LSD1)又称KDM1或AOF2，是第一个被发现的赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶，属于黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖性的H3K4特异性去甲基胺氧化酶家族[5]，与许多肿瘤的发生、发展密切相关[6]。课题组前期研究发现LSD1在肾透明细胞癌组织中高表达，本文以LSD1为靶点，观察其特异性抑制剂反苯环丙胺(tranylcypromine，TCP)对人肾癌786-O细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 TCP购自英国ACROS公司，细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物有限公司，PCR逆转录试剂盒购自Takara公司，MTT、RPMI 1640培养液和胎牛血清购自北京索莱宝科技有限公司。酶标仪购自奥地利Anthos公司，流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 细胞株及细胞培养 人肾癌786-O细胞株购自中国科学院上海生命科学院细胞所，接种于含10 %胎牛血清(含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)的RPMI-1640培养液，培养条件为37 ℃、5 %CO2，将细胞培养至对数生长期时进行研究。

1.3 MTT法检测细胞增殖 将对数生长期的786-O细胞接种于 96 孔培养板，每孔200 μL，细胞密度为2×104个/mL。培养24 h后，吸掉细胞培养液，实验组分别加入不同浓度 TCP，每孔200 μL。空白对照组加入相同体积的培养液，阴性对照组加相同体积的1 ‰DMSO (PBS稀释)，每组设6个复孔，分别培养24、48、72 h后加入5 mg/mL MTT溶液 20 μL，继续培养4 h后用移液器吸净孔内液体，再加入DMSO 150 μL，水平摇床上震荡10 min，用酶标仪在570 nm处测定OD值，重复实验3次。生长抑制率(IR)=(1-加药组OD值/空白对照组OD值)×100%。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 培养24 h后，吸掉细胞培养液，实验组加入终浓度分别为0、10、40、80、160 μM TCP，空白对照组加入培养液，阴性对照组加1‰DMSO，每组设3个复孔，继续培养48 h。采用Annexin V-FITC/PI双染技术检测细胞凋亡。实验重复3次，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数十正常细胞数)。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两组之间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TCP对786-O细胞增殖的影响 TCP作用24、48、72 h后，10 μM组与0 μM组和1‰DMSO组OD值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；随作用时间的延长、药物浓度的增大，抑制作用随之增强，呈现时间-剂量效应关系(P<0.05)；TCP 48 h的IC50值为67.66 μM；见表1。

表1 TCP对786-O细胞增殖的影响(n=6)

注：*与0 μM TCP组比较，P<0.05。

2.2 TCP对786-O细胞凋亡的影响 TCP作用肾癌786-O细胞48 h，与0 μM组比较，DMSO组和10 μM组凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)；随着浓度的增高，与0 μM组比较，40 μM、80 μM、160 μM组早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1，图2。

图1 不同浓度TCP诱导786-O细胞48 h凋亡情况

*与0 μMTCP组比较，P<0.05。图2 不同浓度TCP诱导786-O细胞48 h的凋亡率比较

3 讨论

组蛋白赖氨酸甲基化是转录调节的一个关键因素[7]。LSD1能促进包括肿瘤细胞在内的多种细胞的生长并抑制细胞凋亡，抑制其表达可降低肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡[8]。Lv等[9]研究发现，与正常的肺组织相比，非小细胞肺癌(NSCLC)组织中LSD1的表达量显著增高，且其表达量和NSCLC患者的总生存期呈负相关；同时LSD1的过表达能促进NSCLC细胞的增殖、转移、浸润。Jin等[10]构建质粒将LSD1 基因shRNA转入人结肠直肠癌细胞系HCT116中，沉默LSD1表达，结果发现LSD1缺失可引起体内体外细胞增殖的下调，认为LSD1可能是调控细胞增殖的重要因素之一。Kashyap等[11]发现LSD1在前列腺癌LnCaP、LnCaP:C42和PC3细胞中高表达，应用siRNA技术敲除LSD1基因可以降低血管内皮生长因子(VEGF)水平；帕吉林和反苯环丙胺能有效抑制前列腺癌细胞系的生长，降低前列腺癌的复发。Lan等[12]研究发现，与正常组织相比，LSD1在膀胱癌组织中的表达明显升高，敲除LSD1可以显著抑制膀胱癌细胞系的增殖；且LSD1水平与恶性程度呈正相关。课题组前期研究发现，LSD1在肾透明细胞癌中高表达。

TCP是一种单胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)抑制剂，能够通过与FAD的辅基共价结合形成共价复合物而抑制LSD1的活性[13]。LSD1是 Mi-2/核小体重塑(NuRD)、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)复合体的一个重要组成部分，LSD1/NuRD复合体可以通过影响染色质结构的催化活性来抑制基因转录，能够调控多种信号通路，包括TGF-β1信号通路，参与细胞增殖、细胞生长、上皮-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)等过程的调节[14]。Schenk等[15]用NOD/SCID -IL-2受体-γ缺陷型(NSG)小鼠模型研究LSD1抑制剂TCP和全反式视黄酸(ATRA)联合治疗非早幼粒细胞白血病，结果显示TCP能显著下调H3K4me2蛋白的表达水平，提高全反式维甲酸的疗效。Huang等[16]在MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株中联合应用LSD1抑制剂(TCP、优降宁)和HDAC1/2抑制剂(TSA)，结果显示它们能够使H3K4me2和AcH3K9表达水平提高，表现出对乳腺癌细胞生长的协同抑制作用。本研究结果显示，TCP对肾癌786-O细胞的增殖具有明显的抑制作用，且呈时间-剂量效应关系。

E2F1是细胞周期转录因子E2F家族成员之一，参与多种转录的调控。抑制LSD1表达可调控E2F1和组蛋白H3K4甲基化，下调Bcl-2、Bcl-1和procaspase-3的表达，上调Bax表达，从而诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖[17]。Ma等[18]报道E2F1在786-O和A498细胞系中高表达，能加速细胞周期中的G1/S转换，促进癌细胞的生长。本研究采用流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测显示，随TCP浓度的增高，786-O细胞早期凋亡和晚期凋亡比例都逐渐增加，提示TCP能够抑制肾癌786-O细胞增殖并诱导其凋亡，且呈时间-剂量依赖性。另外，本研究结果还显示，且随TCP药物浓度增高，细胞坏死率也增高，提示TCP具有一定的细胞毒性。

综上，TCP可抑制人肾癌786-O细胞增殖和促进凋亡，后续将进一步研究TCP对LSD1mRNA和蛋白表达的影响，对786-O细胞转移和侵袭活性的影响，并对其相关通路进行研究。