20例份血清学弱D表型抗凝血液标本的RHD基因型检测分析

吴丽娜，解金辉，安仕萍，李双玉

(天津市血液中心，天津300110)

Rh血型系统是国际输血协会(ISBT)确认的红细胞血型系统中最复杂、最具多态性的血型系统，其至少由45个独立的抗原组成，常见的抗原包括D、C、c、E、e 5种抗原，其中D抗原免疫性最强。根据红细胞D抗原的有无，可分为红细胞RhD阳性血型和RhD阴性血型。D抗原由1号染色体上的RHD基因编码，该基因含有10个外显子。基因缺失、基因交换、碱基变异等均可导致RHD等位基因的形成。研究[1]显示，RHD等位基因的出现可导致D抗原数量表达下调或部分D表位缺失，RhD表型出现变化，称为RhD变异型。迄今已发现超过270种RhD变异型[2]，包括部分D表型、弱D表型以及DEL表型[3]。临床一般采用盐水介质法鉴定Rh血型，但该方法不能准确区分RhD变异型。在盐水介质中加入抗-D单克隆抗体后红细胞反应为无凝集或弱凝集(≤2+)，加入抗球蛋白(AHG)后发生凝集，称之为血清学弱D表型(SWDP)[4～6]。研究[7]显示，SWDP与红细胞膜上或者膜内D抗原中的一种或者多种氨基酸的替换有关，导致了红细胞表面D抗原表达减少。本研究收集了20例份血清学检测结果表现为SWDP的标本进行RHD等位基因分型，分析SWDP标本的基因型及各变异型的分布情况。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 SWDP抗凝血液标本及试剂 选取2016～2018年天津市血液中心保存的SWDP抗凝血液标本20例份，均经盐水介质法、间接抗球蛋白法鉴定为SWDP。RHD等位基因检测试剂盒购自天津市秀鹏生物技术开发有限公司。

1.2 RHD基因型检测 在已加入25 μL蛋白酶K的离心管中加入1 mL的SWDP抗凝血液标本，振荡混匀10 s，加入250 μL细胞裂解液，70 ℃裂解10 min，加入250 μL无水乙醇溶解DNA，将液体转移至新的收集管，使用Buffer洗脱提取DNA。以DNA为模板，进行序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)扩增。引物序列如下：启动子+第1外显子上游引物为5′-CTAGAGCCAAACCCACATCTCCTT-3′，下游引物为5′-AGAAGATGGGGGAATCTTTTTCCT-3′；第2外显子上游引物为5′-ATTAGCCGGGCACGGTGGCA-3′，下游引物为5′-AAAGGATGCAGGAGGAATGTAGGC-3′；第3外显子上游引物为5′-GTGCCACTTGACTTGGGACT-3′，下游引物为5′-AGGTCCCTCCTCCAGCAC-3′；第4外显子上游引物为5′-TGGCAAGAACCTGGACCTTGACTTT-3′，下游引物为5′-TCCTGAACCTGCTCTGTGAAGTGC-3′；第5外显子上游引物为5′-TACCTTTGAATTAAGCACTTCACAG-3′，下游引物为5′-TTATTGGCTACTTGGTGCC-3′；第6外显子上游引物为5′-CAAAAACCCATTCTTCCCG-3′，下游引物为5′-ACCCAGCAAGCTGAAGTTGTAGCC-3′；第7外显子上游引物为5′-TCTCAGCTCACTGCAACCTC-3′，下游引物为5′-GCTTGAAATAGAAGGGAAATGGGAGG-3′；第8外显子上游引物为5′-CCAGGTTGTTAAGCATTGCTGTACC-3′，下游引物为5′-CACCCGCATGTCAGACTATTTGGC-3′；第9外显子上游引物为5′-CCAGGTTGTTAAGCATTGCTGTACC-3′，下游引物为5′-CACCCGCATGTCAGACTATTTGGC-3′；第10外显子上游引物为5′-CAAGAGATCAAGCCAAAATCAGT-3′，下游引物为5′-AGCTTACTGGATGACCACCA-3′。建立10 μL反应体系：样本DNA为1 μL，dNTP-Buffer工作液9 μL。PCR反应条件：96 ℃ 2 min，96 ℃ 20 s、68 ℃ 60 s(5个循环)，96 ℃ 20 s、65 ℃ 50 s、72 ℃ 45 s(10个循环)，96 ℃ 20 s、62 ℃ 50 s、72 ℃ 25 s(5个循环)，72 ℃ 5 min，4℃保存。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶图像分析系统观察结果。

1.3 RHD基因测序 如采用SSP-PCR法不能确定基因型，则将扩增产物送至天津市秀鹏生物技术有限公司，采用DNA序列分析技术(SBT)进行基因测序，测序结果与GenBank标准RHD基因序列(BN000065)进行比较，确定其基因型。

2 结果

2.1 RHD基因型检测结果 20例份SWDP抗凝血液标本中，19例份经RHD基因型检测可以确定其基因型，其中弱D15型RHD等位基因12例份、部分D型RHD等位基因6例份[DⅥ Ⅲ型5例份、DVA(Hus)型1例份]、DEL型RHD等位基因1例份(1 227 G>A)；1例份经SSP-PCR检测未能确定基因型。

2.2 RHD基因测序结果 未能确定基因型的1例份标本，其RHD基因第8外显子的1 100号碱基发生T>A的纯合突变，见图1。该突变导致D抗原的第367位氨基酸由异亮氨酸突变为天冬氨酸，该突变点在红细胞血型抗原突变数据库中未找到对应的等位基因，为新发现RHD等位基因，其血清学意义暂不明确。

图1 1例份SWDP抗凝血液标本RHD基因第8外显子部分测序结果

3 讨论

2014年，美国麻醉医师学会输血医学资源委员会对3 100家实验室关于SWDP结果的检测方法与报告策略进行了调查，结果显示，约47%的实验室将SWDP结果报告为“RhD阳性”，11%的实验室报告为“RhD阴性”，30%的实验室报告为“弱D”[8]。他们通过这项调查发现，当SWDP出现的时候，美国缺乏统一的RhD分型评判标准，这直接导致了实验报告不一致。

研究[5]显示，SWDP的分布因人种和民族而不同。在欧洲和美国，SWDP是最常见的RhD变异型，SWDP相关的RHD等位基因与同种免疫的关系也多见于对欧洲白人的研究，其中弱D1、2、3型最为多见[7，9，10]，且这3种类型的受血者均无产生同种抗-D风险，可按RhD阳性对待[11，12]。与欧美国家不同的是，在SWDP相关的RHD等位基因中，弱D15型在中国人中最为常见。本研究的20例份SWDP抗凝血液标本中，共检测出弱D15型RHD等位基因12例份，占60%。本研究样本数虽不足以有效地统计分析中国人群中弱D表型RHD等位基因的分布频率，但足以发现欧洲人群和中国人群弱D表型的分子机理存在较大差异。

研究[7]显示，部分D表型与红细胞表面D蛋白氨基酸的替换有关，导致红细胞缺乏某些D抗原表位。部分D表型的人输注RhD阳性血液时产生抗-D的比例尚未得知，但是已有被误认为RhD阳性其实可能为部分D型的人产生抗-D抗体的报道[13]，而这些产生抗-D抗体的人是弱D表型还是部分D表型并没有被区分。DⅥ型是欧洲人中最常见的部分D表型的基因型之一[14]。研究[15]发现，目前确认的DⅥ表型都是RHD和RHCE基因转换引起，并非RHD外显子的缺失，与本研究结果一致。如果将DⅥ型血液当做RhD阴性血液输注给RhD阴性人群，则有可能导致溶血性输血反应的发生。研究[16]显示，携带部分D基因的女性患者产生抗-D抗体以后发生了非常严重的溶血性输血反应。目前美国食品药品监督管理局规定现行的单克隆IgM抗-D试剂需有效避免DⅥ型的检出。本研究检出部分D型6例份，其中DⅥ Ⅲ型5例份、DVA(Hus)型1例份，占比较高。

DEL表型通常情况下在血清学实验中表现为RhD阴性，只有进行吸收放散实验才能够检出[17]。DEL表型在白人和黑人中罕见[18]，但在中国RhD阴性汉族人群中常见，约占30%[19]。中国汉族人群中DEL等位基因主要是RHD 1 227 G>A。一些研究[20,21]认为，DEL表型的受血者由于红细胞表面的D抗原数目较少，输注DEL表型的血液不会引起同种免疫的发生。然而，已有许多的报道[22]证实，RhD阴性志愿者输注DEL表型的血液后会产生同种免疫，通常认为这种免疫为二次免疫，即输注DEL表型的血液导致已存在抗-D抗体的病人抗-D抗体效价增高。本研究检出DEL型RHD等位基因1例份，为RHD 1 227 G>A等位基因，与报道的较常见的DEL等位基因型一致。

本研究中，1例份SWDP抗凝血液标本经SSP-PCR检测未能确定其基因型，进行基因测序进一步确定其基因型。经基因测序发现，RHD基因的第8外显子的1 100号碱基发生T>A的纯合突变，导致D抗原的第367位氨基酸由异亮氨酸突变为天冬氨酸，蛋白质一级结构发生变化，导致D抗原在与抗-D单克隆血清反应时为阴性反应，间接抗球蛋白实验为阳性反应，其血清学反应结果与部分D表型较为相似。此点突变是否导致了D抗原的数量或者抗原决定簇的改变需要进一步研究，从而探讨其是否能够引起同种免疫，接下来我们将对该新基因携带者进行家系调查，检测其是否能够稳定遗传。

综上所述，本研究20例份SWDP抗凝血液标本中弱D15型和DⅥ型RHD等位基因较多。本研究新发现1例RHD等位基因。RHD基因型的检测及其能否导致同种免疫的发生,已成为近年来国际免疫血液学领域中研究热点之一[23]。西方国家已经开始对RHD基因分型进行研究调查，我国SWDP的分布与西方不同，应大力开展RHD基因分型和相关研究，探明SWDP发生率及其基因型分布，条件成熟时建立符合我国国情的RHD的基因分型处理指南。