宫颈癌组织中miR-181a、GRP78 mRNA表达变化及其意义

王宏，李娜，罗颖

(本溪市中心医院，辽宁本溪117000)

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，发病率在女性恶性肿瘤中排第2位，全球每年约有50万例新发病例，死亡例数达26万例，中国每年新发病例达13万，死亡例数约5万例[1]。近年来新的治疗模式及靶向药物的发展，增加了宫颈癌的临床治疗疗效，提高了患者的生活质量[2]。但因肿瘤具有高度克隆异质性和细胞信号调节的复杂性特点，目前抗肿瘤治疗效果有限，中晚期宫颈癌患者的5年总体生存率仅约40%[3]。因而，有必要深入研究宫颈癌发生发展的分子机制，寻找新的诊断及治疗的生物学靶点。微小RNA(miRNA)是长度约18～25个核苷酸的RNA调控分子，其能与靶基因转录产物mRNA的3′端非翻译区结合，改变mRNA的稳定性，促进mRNA降解，影响基因表达，参与细胞增殖、凋亡、迁移及分化等过程的调控[4]。近年来研究[5]表明，miR-181a通过抑制癌基因T细胞淋巴瘤断点1(TCL1)的表达，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭，并促进肿瘤细胞凋亡，在miR-181a低表达后肿瘤细胞的增殖、侵袭能力增强。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)，又称为免疫球蛋白重链结合蛋白，是热休克蛋白70家族的成员。GRP78位于内质网的内腔中，参与内质网中蛋白质的折叠和组装，还参与内源性细胞保护过程，可将新合成的多肽转移到内质网膜上，促进错误折叠的蛋白质被蛋白酶降解。近年来研究[6，7]表明，GRP78在胃癌、前列腺癌等多种肿瘤中表达升高，可能与其激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝苏氨酸激酶1(AKT)途径促进肿瘤细胞增殖有关。有研究[8]报道，在宫颈癌肿瘤细胞系中发现miR-181a能调控GRP78基因的表达，进而影响肿瘤细胞的增殖、血管生成及奥沙利铂耐药性形成等过程。但目前，miR-181a与GRP78在宫颈癌中的调控机制及两者之间的关系尚未明确，还需进一步研究。本研究通过检测宫颈癌组织中miR-181a与GRP78 mRNA的表达情况，分析两者与宫颈癌患者临床病理参数及预后的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月～2016年3月本溪市中心医院收治的宫颈癌患者93例，患者年龄31～73岁，平均(46.5±9.3)岁；其中鳞癌79例、腺癌14例，高分化25例、中分化37例、低分化31例，FIGO分期Ⅰ期51例、Ⅱ期42例[9]，浅肌层浸润40例、深肌层浸润53例，淋巴结转移58例、无淋巴结转移35例。纳入标准：①宫颈癌诊断均经活检病理或术后病理确诊；②既往未接受放化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗；③临床病理资料完整，患者及家属均知情同意并已签字。排除标准：①合并其它器官的恶性肿瘤；②既往有其它宫颈疾病如宫颈上皮内瘤变或因宫颈疾病手术治疗的病史；③合并严重心肝肺肾等脏器功能不全。选取同期接受子宫切除术的子宫肌瘤患者40例，患者年龄33～58岁，平均(45.1±7.2)岁。两组患者之间年龄无显著差异(P>0.05)。患者均接受手术切除治疗，术中留取宫颈癌组织或正常宫颈组织，迅速置于冻存管内，液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱保存。患者出院后均进行门诊或电话随访，记录患者生存情况。随访终止日期为2019年3月，随访1～48个月，中位随访时间30.1个月。

1.2 宫颈癌组织及正常宫颈组织中miR-181a、GRP78 mRNA检测及分析方法 采用qRT-PCR法。取30 mg组织标准，TRIzol法提取宫颈癌组织及正常宫颈组织中总RNA，并溶于RNAase-free的ddH2O中，分光光度测定仪检测RNA浓度及纯度。以2 μg总RNA为模板，逆转录合成cDNA，实验步骤严格按照逆转录试剂盒说明书进行。引物序列如下：miR-181a上游引物为5′-ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTCG-3′，下游引物为5′-GGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3′，GRP78上游引物为5′-CATCACGCCGTCCTATGTCG-3′，下游引物为5′-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3′，内参基因U6上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。荧光定量PCR反应条件为：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40个循环。PCR总反应体系为20 μL，其中模板3μL，上下游引物各1 μL，SYBR premix Ex TaqⅡ 12 μL，加去离子水补足体系至20 μL。所有反应均在ABI实时定量PCR仪上完成，每个样本重复3次。以2-ΔCt表示目的基因的相对表达量。以宫颈癌组织中miR-181a、GRP78 mRNA相对表达量的中位数为临界值，将93例宫颈癌患者分为miR-181a高表达组、miR-181a低表达组和GRP78 mRNA高表达组、GRP78 mRNA低表达组，并分析miR-181a、GRP78 mRNA相对表达量与宫颈癌患者预后的关系。

2 结果

2.1 宫颈癌组织与正常宫颈组织中miR-181a、GRP78 mRNA表达比较 宫颈癌组织中miR-181a、GRP78 mRNA相对表达量分别为0.524±0.105、1.208±0.340，正常宫颈组织中miR-181a、GRP78 mRNA相对表达量分别为1.613±0.580、0.647±0.132，两者相比，P均<0.05。

2.2 宫颈癌组织中miR-181a、GRP78 mRNA表达的相关性 宫颈癌组织中miR-181a、GRP78 mRNA表达呈负相关关系(r=-0.645，P=0.000)。

2.3 miR-181a、GRP78 mRNA表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系 miR-181a、GRP78 mRNA表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系见表1。表1显示，miR-181a、GRP78 mRNA表达与宫颈癌患者肿瘤FIGO分期、分化程度有关(P均<0.05)，而与年龄、病理类型、浸润深度及淋巴结转移无关(P均>0.05)。

表1 miR-181a、GRP78 mRNA表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系

2.4 miR-181a、GRP78 mRNA相对表达量与宫颈癌患者预后的关系 以宫颈癌组织中miR-181a相对表达量的中位数0.524为临界值进行分组，其中miR-181a高表达组45例，miR-181a低表达组48例。Kaplan-Meier生存分析结果显示，miR-181a高表达组3年总体生存率(OS)为84.4%(38/45)，miR-181a低表达组3年OS为79.1%(38/48)，两组间患者3年OS相比，P>0.05。

以宫颈癌组织中GRP78 mRNA相对表达量的中位数1.208为临界值进行分组，其中GRP78 mRNA高表达组46例，GRP78 mRNA低表达组47例。Kaplan-Meier生存分析结果显示，GRP78 mRNA高表达组3年OS为67.4%(31/46)，GRP78 mRNA低表达组3年OS为96.7%(45/47)，两组间患者3年OS相比，P<0.05。

3 讨论

宫颈癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，发展中国家女性发病率及死亡率高于发达国家，中年女性多见[10]。对宫颈癌的细胞学及人乳头瘤病毒DNA的筛查，有助于宫颈癌的早期诊断，但对许多发展中国家来说，宫颈癌筛查的覆盖率较低，宫颈癌死亡率仍居高不下。因此，深入研究宫颈癌的发生发展机制，寻找新的早期诊断、判断预后的分子标志物对于宫颈癌的诊断治疗具有重要的意义。

miRNA长度为18～25个核苷酸，miRNA的编码基因在RNA聚合酶的作用下转录为初级miRNA，然后在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成具有茎环结构miRNA前体，核糖核酸酶Ⅲ进而将其剪切为成熟的miRNA后结合到RNA诱导的沉默复合物中，与靶基因mRNA的3′端非翻译区结合，改变mRNA的稳定性，影响mRNA翻译过程[11]。miR-181a是一种小非编码RNA，其编码基因位于染色体1q32.1，有一个外显子。近年来研究[12]表明，miR-181a在乳腺癌等多种肿瘤中存在异常表达的现象，并且miR-181a在肿瘤增殖、浸润和转移等过程中发挥重要的调控作用。本研究结果显示，宫颈癌组织中miR-181a的相对表达量明显低于正常宫颈组织。我们认为其表达下调的机制，可能与肿瘤发生时长链非编码RNA癌症易感性候选物基因2通过表观遗传学修饰抑制miR-181a基因表达有关，miR-181a表达降低后癌基因AKT表达增加，而抑癌基因磷酸酶-张力蛋白基因表达降低，促进肿瘤细胞的增殖并抑制凋亡[13]。本研究中，FIGO分期Ⅱ期、低分化癌组织中miR-181a相对表达量分别显著低于FIGO分期Ⅰ期、高中分化癌组织中miR-181a水平，表明miR-181a参与宫颈癌发生发展过程。其机制可能与miR-181a对Wnt信号通路中的关键转录因子淋巴增强因子-1(LEF-1)基因的抑制作用减弱有关，LEF-1基因表达增加，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，增强肿瘤细胞的浸润能力，导致肿瘤的恶性进展，肿瘤分期分级增高[14，15]。本研究中进一步分析不同miR-181a表达水平患者3年OS的差别，结果miR-181a高表达组与miR-181a低表达组患者3年OS无明显差异，表明miR-181a不是影响患者预后的关键因素。分析其原因，一方面可能与本研究随访时间较短有关，我们可以延长随访时间观察miR-181a表达对宫颈癌患者生存预后的影响；另一方面，宫颈癌发生发展过程中受到多种miRNA表达调控，形成对癌基因和抑癌基因表达调控的复杂的RNA网络[16]。因此，有待深入研究宫颈癌中RNA表达调控的关键机制，指导临床诊断和治疗。

GRP78是位于内质网上的一种应激性蛋白，参与抑制内质网新生肽的聚集、调控异常折叠蛋白、维持细胞及内质网中的钙稳态的作用。近年来，在喉鳞状细胞癌的研究[17]中，发现癌细胞表面存在GRP78异常高表达的现象，与肿瘤的发生发展密切相关。本研究中，宫颈癌组织中GRP78 mRNA明显高于正常宫颈组织，表明宫颈癌组织GRP78 mRNA表达增加，其机制可能是肿瘤发生时抑制GRP78基因表达的微小RNA如miR-495、miR-199a-5p等表达降低，结合到GRP78 mRNA的3′端非编码区形成RNA诱导的沉默复合物减少，最终导致GRP78 mRNA表达增加[18]，进而促进细胞增殖信号通路(如PI3K/Akt)的活化、细胞凋亡相关蛋白酶活化受到抑制等，促进肿瘤的发生。本研究中，宫颈癌组织中GRP78 mRNA的表达与FIGO分期、分化程度有关，FIGO分期越高、分化越差的癌组织中GRP78 mRNA水平越高，表明GRP78 mRNA参与肿瘤的发展，可作为反映肿瘤恶性程度的指标。其原因是肿瘤发生时GRP78 mRNA促进局部黏着斑激酶的活化，进而激活JNK信号通路的活化，促进基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达，促进肿瘤的局部浸润能力[19]。本研究中，GRP78 mRNA高表达组3年OS明显低于GRP78 mRNA低表达组，表明GRP78 mRNA有可能成为反映患者生存预后的分子生物学指标。有研究[20]应用荧光素酶报告基因实验表明，GRP78 mRNA是miR-181a的重要作用靶点，miR-181a表达增加能够直接抑制GRP78 mRNA表达。本研究中，miR-181a与GRP78 mRNA表达呈明显负相关，表明miR-181a可能在宫颈癌发生发展中存在调控GRP78 mRNA表达的作用。

综上所述，宫颈癌组织中miR-181a低表达、GRP78 mRNA高表达，miR-181a与GRP78 mRNA表达呈负相关，miR-181a及GRP78 mRNA表达与FIGO分期、分化程度有关，两者共同参与宫颈癌的发生发展过程，有可能成为新的宫颈癌诊断、治疗及预后评估的分子标志物。GRP78 mRNA高表达的宫颈癌患者术后生存率低，GRP78 mRNA可能成为反映患者生存预后的分子生物学指标。