宫颈癌组织中SALL3、DNMT3A、甲基化SALL3基因表达观察

赵娟，魏星，杨婷，赵敏伊，杨筱凤

(1 西安交通大学第一附属医院，西安710061；2 西安交通大学第二附属医院)

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一。研究[1]显示，我国每年新发病例数达13.1万，死亡例数达5.3万，占所有女性恶性肿瘤的18%。近年来，宫颈癌新的诊断和治疗技术得到不断发展，但患者的5年总体生存率仅在40%左右，因此明确宫颈癌发生发展的机制，寻找宫颈癌早期诊断指标及治疗方案具有重要的临床意义[2]。研究[3]表明，表观遗传学调控如甲基化、乙酰化、糖基化等，参与了宫颈癌的发生发展。DNA甲基化修饰在基因表达调控过程中发挥重要作用，DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，使CpG岛中5′端胞嘧啶甲基化，而CpG岛多位于基因启动子附近，因此DNA甲基化后将抑制基因转录。DNMT家族包括DNA甲基化维持酶(DNMT1)、DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)和DNA甲基转移酶3B(DNMT3B)3个成员，在DNA甲基化的启动和维持中发挥重要作用。研究[4]显示，DNMT3A在多种肿瘤中高表达，可通过直接或协同作用导致抑癌基因异常甲基化而沉默其表达。spalt样转录因子3(SALL3)是SAL基因家族的成员，位于染色体18q23，SALL3基因编码产生含有4个锌指结构的转录因子。研究[5]显示，SALL3基因启动子在肿瘤发生时存在异常甲基化现象，导致SALL3基因表达水平降低。研究[6]发现，SALL3能通过双锌指结构域与DNMT3A的PWWP结构域结合，抑制DNMT3A，而在肿瘤发生时SALL3表达降低，导致抑制DNMT3A能力下降，DNMT3A活性增强后进而抑制抑癌基因的表达，促进肿瘤的发生发展。目前有关宫颈癌中SALL3及DNMT3A表达的研究较少。本研究观察了宫颈癌组织中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA及甲基化SALL3基因表达情况，分析SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表达的相关性及其与宫颈癌患者临床病理参数的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年12月～2018年12月西安交通大学第一附属医院诊治的宫颈癌患者200例，患者年龄27～56岁，平均(42.9±7.1)岁，其中宫颈鳞癌161例、子宫腺癌39例，肿瘤高分化57例、中分化65例、低分化78例，肿瘤分期Ⅰ期112例、Ⅱ期88例[7]，浅肌层浸润81例、深肌层浸润119例，淋巴结转移117例、无淋巴结转移83例。纳入标准：①均经宫颈活检病理或术后病理检查确诊为宫颈癌；②均为初次诊治，既往未接受其它抗肿瘤治疗；③临床病理资料完整，患者及家属均知情同意并已签署知情同意书。排除标准：①合并其它器官系统的恶性肿瘤；②合并急性感染性疾病，如上呼吸道感染等；③合并严重的脏器功能不全，如心功能衰竭、肝功能衰竭等。选取同期接受手术治疗的子宫肌瘤患者40例，患者年龄34～56岁，平均(42.1±6.8)岁。本研究中，200例宫颈癌患者与40例子宫肌瘤患者年龄间无显著差异(P>0.05)。患者均接受手术切除治疗，宫颈癌患者术中留取宫颈癌组织，子宫肌瘤患者术中留取正常宫颈组织，留取的组织标本迅速置于冻存管内，液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存。

1.2 宫颈癌组织及正常宫颈组织中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA检测方法 采用qRT-PCR法。取约30 mg组织标本，TRIzol法提取总RNA，溶于80 μL无RNA酶的ddH2O中，核酸蛋白测定仪上检测RNA浓度。以2 μg总RNA为模板，逆转录合成cDNA，总反应体系为20 μL，实验步骤严格按照逆转录试剂盒说明书进行。以cDNA为模板，进行荧光定量PCR反应。引物序列如下：SALL3正向引物为5′-CCAATGTGTCGGTGTTCGAG-3′，反向引物为5′-CCGGGTAAGGGTTCATCTGG-3′；DNMT3A正向引物为5′-CCGATGCTGGGGACAAGAAT-3′，反向引物为5′-CCCGTCATCCACCAAGACAC-3′；内参基因GAPDH正向引物为5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物为3′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-5′。荧光定量PCR反应条件为：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40个循环。所有反应均在ABI实时定量PCR仪上完成，每个样本重复3次。以2-ΔCt表示目的基因的相对表达量。

1.3 宫颈癌组织及正常宫颈组织中甲基化SALL3基因表达观察 应用酚-氯仿法提取、纯化组织DNA，实验步骤按照TaKaRa Mini DNA 提取试剂盒说明书进行，琼脂糖凝胶电泳鉴定。应用亚硫酸氢钠修饰提取的500 ng基因组DNA，以将DNA中尚未甲基化的胞嘧啶(C)修饰为尿嘧啶(U)，操作步骤按照EZ DNA Methylation-Gold Kit说明书进行，然后进行甲基化特异PCR扩增。引物序列如下：SALL3基因甲基化正向引物：5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTCGTC-3′,反向引物：5′-ATAACCTCCTAAAACTTCCCCGAA-3′；SALL3基因非甲基化正向引物：5′-ATTTTAGAATGGAAGGGAGTTTGTTG-3′,反向引物：5′-AAATAACCTCCTAAAACTTCCCCAAA-3′。PCR反应体系根据PCR反应试剂盒说明进行。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min；然后进行40个循环的扩增反应，程序为95 ℃变性30 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸8 min，4 ℃保温。PCR反应结束后取10 μL反应产物，应用2%琼脂糖凝胶进行电泳，以去离子水为阴性对照，应用成像分析系统照相，根据DNA条带判断结果。甲基化阳性结果判断方法：甲基化引物扩增出目的条带，而非甲基化引物未扩增出目的条带；甲基化阴性结果判断方法：甲基化引物未扩增出目的条带，而非甲基化引物扩增出目的条带。用图像分析系统计算受检标本的甲基化条带密度值，即为标本的相对甲基化程度。

2 结果

2.1 宫颈癌组织与正常宫颈组织中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表达比较 宫颈癌组织中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA相对表达量分别为0.253±0.051、0.272±0.055，正常宫颈组织中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA相对表达量分别为1.050±0.062、0.093±0.016，两者相比，P均<0.05。

2.2 宫颈癌组织中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表达的相关性 宫颈癌组织中SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表达呈负相关(r=-0.679，P=0.000)。

2.3 SALL3 mRNA、DNMT3A mRNA表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系 结果见表1。表1显示，SALL3、DNMT3A mRNA表达与宫颈癌患者FIGO分期、分化程度有关(P均<0.05)。

2.4 宫颈癌组织及正常宫颈组织中甲基化SALL3基因比较 宫颈癌组织中SALL3基因甲基化率为60.5%(121/200)，相对甲基化程度为1.72±0.61；正常宫颈组织中SALL3基因甲基化率为30.0%(12/40)，相对甲基化程度为0.26±0.07；两者相比，P均<0.05。

3 讨论

DNA甲基化是表观遗传修饰的最常见形式，通过基因表达调控，参与各种分化发育、炎症、自身免疫和肿瘤的发生发展过程。研究[8]表明，启动子区域特别是CpG岛异常的DNA甲基化与许多癌症的发生密切相关。在结直肠癌研究[9]中发现，β-环连蛋白抑制基因2(DACT2)为一种抑癌基因，其基因启动子区域存在高甲基化的现象，DACT2表达降低可能参与了结直肠癌的发生发展,而DNA高甲基化是DACT2的重要表达调控机制。此外，研究[10]发现，谷胱甘S-转移酶P1(GSTP1)保护细胞避免DNA损伤和癌细胞形成,GSTP1基因启动子甲基化可能造成GSTP1基因低表达，GSTP1活性降低导致DNA损伤的敏感性增强和癌变发生的概率增加。因此，肿瘤相关基因的异常甲基化在致癌过程中起重要作用，研究宫颈癌中特异性基因甲基化具有重要意义。

表1 SALL3、DNMT3A mRNA表达与宫颈癌患者临床病理参数的关系

SALL3是SAL家族的成员，其参与人类多个系统的发育过程，该基因表达缺失患者表现为先天性心脏疾病、精神发育迟滞、生长发育迟缓及肢体畸形等。近年来研究[11]表明，SALL3表达水平与肿瘤的发生发展之间关系密切，在肝细胞癌中，SALL3基因启动子被DNA甲基化修饰，SALL3高甲基化降低了肝细胞癌中SALL3的表达水平，SALL3的异常高甲基化有助于肝细胞癌的发生。本研究中，宫颈癌组织中SALL3基因表达在mRNA水平上明显低于正常宫颈组织，表明宫颈癌组织中SALL基因表达降低。进一步分析发现，宫颈癌组织中SALL3 mRNA表达与FIGO分期、肿瘤分化程度有关，FIGO分期越高、分化越低的癌组织中SALL3 mRNA相对表达量越低，表明SALL3 mRNA相对表达量能够反映宫颈癌病情严重程度，有望成为新的肿瘤相关标志物。我们认为，其机制可能是随着肿瘤进展，肿瘤微环境中IL-7等细胞因子结合细胞表面的IL-7Rα，进而抑制转录因子SALL3的表达[12]。此外，SALL基因启动子区域存在表观遗传学修饰的现象，也可降低SALL3基因表达。Yu等[13]在膀胱癌患者尿液中脱落的肿瘤细胞中发现SALL3富含CG的启动子区域高度甲基化，认为SALL3可能是检测膀胱癌的新型DNA甲基化标记物。本研究进一步检测SALL3基因甲基化表达情况，结果显示宫颈癌组织中SALL3基因甲基化率及相对甲基化程度均显著高于正常宫颈组织，表明SALL3基因的表观遗传学修饰可能参与肿瘤的发生发展，特别是肿瘤的早期阶段，因而检测SALL3基因甲基化情况有可能成为宫颈癌的早期诊断方法。目前SALL3基因异常高甲基化的机制尚不清楚，可能与HPV感染有关。有研究[14]报道，在宫颈癌SiHa、HeLa两种HPV阳性细胞系中均存在SALL3基因启动子区域中高甲基化的现象，但在HPV阴性细胞系C33A中SALL3基因在启动子区域未出现甲基化现象，因而HPV的感染可能参与诱导SALL3基因甲基化，参与相关的致癌机制。

DNMT3A基因编码DNA甲基转移酶，是甲基化调节的关键酶，参与从头甲基化过程，DNMT3A蛋白定位于细胞质和细胞核。有研究[15]表明，DNMT3A与异染色质的组分相互作用，包括HP1、HDAC和组蛋白甲基转移酶，在染色质结构的调节中起重要作用。研究[16]发现，DNMT3A基因突变参与肿瘤的发生发展过程，在25%的急性髓性白血病(AML)患者中常发生DNMT3A基因R882位点突变。本研究中，宫颈癌组织中DNMT3A在mRNA相对表达量上表达明显高于正常宫颈组织，且宫颈癌组织中DNMT3A mRNA表达与FIGO分期、肿瘤分化程度有关，FIGO分期越高、分化越低的癌组织中DNMT3A mRNA相对表达量越高，提示宫颈癌组织中DNMT3A mRNA表达升高可能参与宫颈癌的病情发展。DNMT3A表达升高的机制尚不清楚，可能与宫颈癌组织中SALL3基因高甲基化后SALL3表达降低，导致SALL3对DNMT3A的抑制作用减弱，DNMT3A的表达上调后促进抑癌基因的从头甲基化，促进了宫颈癌的发生[13]。本研究中，SALL3与DNMT3A mRNA表达呈显著负相关，表明两者可能存在相互作用，有待进一步深入研究。

综上所述，宫颈癌组织中SALL3 mRNA低表达、DNMT3A mRNA高表达，两者负相关，SALL3、DNMT3A mRNA表达与宫颈癌FIGO分期、分化程度有关，两者共同参与宫颈癌的发生发展过程，有希望成为新的诊断、治疗及预后评估的肿瘤标志物。宫颈癌组织中SALL3基因甲基化率及相对甲基化程度升高，检测甲基化SALL3基因情况有可能成为宫颈癌的早期诊断方法。