热脱附-气相色谱/质谱联用分析初榨橄榄油挥发性风味成分

雷春妮 周小平 高黎红 金 凤 解迎双 马 鑫 齐安安 宋亚娟 王慧珺

初榨橄榄油(virgin olive oil)是由新鲜的油橄榄果实直接冷榨而成，不经加热和化学处理，完好地保存了最初的化学结构、天然营养成分以及原果实的口味和香气，几乎是世界上唯一的天然状态冷餐植物油[1]。由于橄榄油具有极佳的天然保健功效、美容功效和理想的烹调用途而被公认为绿色保健食用油,素有“液体黄金”的美誉[2,3]。橄榄油特有的风味与其质量和经济效益呈正相关，其含有的挥发物的种类、含量及相互间协调和抑制作用反映出的橄榄油风味在很大程度上决定其感官品质，并影响不同人群的消费行为，也能体现其在加工、储藏等过程中的品质变化，可见研究橄榄油挥发性风味成分具有重要价值。

如何对风味成分进行提取是橄榄油香味分析的关键步骤，选择适宜的提取方法关系到橄榄油风味成分定性及定量分析的准确性。目前，对于食用油风味成分的提取方法常见的有液萃取法(Liquid-liquid extraction，LLE)、顶空法(Headspace,HS)和固相微萃取法(solid phase microextraction， SPME)[4-12]。此外，热脱附法(thermal desorption，TD)作为一种新型的挥发性成分分析预处理方法，具备操作简单，灵敏度高，绿色环保，检测限可达到10-9级等优点，常见于环境、卷烟和植物挥发性物质的提取分析，以及少量应用于食品风味测定[13-17]，而至今尚无热脱附法分析食用油挥发性风味成分的报道。

本实验分别采用液液萃取法、顶空法、顶空固相微萃取法及热脱附法对橄榄油的挥发性风味成分进行提取，采用MassworksTM质谱软件结合气相色谱-质谱法(gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS)对结果进行定性分析，弥补了常规GC-MS谱库检索定性的不足，并针对最佳提取方法进行了参数优选，旨在确定适宜橄榄油风味成分分析的最佳提取方法，为橄榄油风味的有效评价提供依据。

1 材料与方法

1.1材料与设备

样品：选取瓦耶霍特级初榨橄榄油为1号(西班牙)、伯爵特级初榨橄榄油为2号(西班牙)、太平之选特级初榨橄榄油为3号(西班牙)、帆船牌特级初榨橄榄油为4号(西班牙)、得科特级初榨橄榄油为5号(意大利)、卡拉佩利混合橄榄油为6号(意大利)、卡拉佩利特级初榨橄榄油为7号(意大利)、巴基斯坦特级初榨橄榄油为8号(巴基斯坦)、PATEROMIIICHELAKIS特级初榨橄榄油为9号(希腊)、叙利亚特级初榨橄榄油为10号(叙利亚)、祥宇特级初榨橄榄油为11号(中国)。本实验的橄榄油样品均有甘肃陇南祥宇有限公司提供。

Agilent 7890A/5975C气相色谱/质谱联用仪；Clarus 600气相色谱仪；AutoTD自动热脱附解吸仪、AutoHS 自动顶空进样器、集热式恒温加热器、90 mm×6.4 mm不锈钢采样管(内装150 mg Tenax-TA吸附剂)；手动固相微萃取装置、萃取纤维头(2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μmPA、100 μmPDMS)；SHC型纯净空气泵。

1.2 分析方法

1.2.1 风味物质的提取方法

表1 风味物质的提取方法

注：“—”表示没有采用进样仪器。

1.2.2 气相色谱-质谱联用分析条件

色谱条件：色谱柱：HP-INNOWAX(60 m×0.250 mm×0.5 μm)；程序升温：初始温度60 ℃，保持1 min，以2 ℃/min的速率升至255 ℃，保持20 min；载气：高纯氦气(纯度≥99.999%)；进样口温度：260 ℃；恒压模式：10 psi；分流比：5∶1。

质谱条件：电子电离(EI)源；电子能量：70 eV；接口温度250 ℃；离子源温度：230 ℃；溶剂延迟：8 min；质量扫描范围：m/z25～550 u。

2 结果与分析

2.1 提取方法的选择

以祥宇特级初榨橄榄油为原料，选择橄榄油挥发性成分的总峰面积、总峰个数作为分析依据，对提取方法进行优选。同一橄榄油样品在不同的提取方式下获得挥发性组分，仪器进样参数一致，色谱图在同一积分事件下获得色谱图峰面积和峰个数的数据，液液萃取法、顶空法、固相微萃取法、热脱附法提取橄榄油挥发性组分对比结果见表2。如表2所示，顶空法对轻组分有所提取，对重组分几乎没有提取效果，色谱图在12 min以后，基本没有出峰，而峰面积和峰个数在四种提取方法中最低；液液萃取获得的色谱图在四种提取方法中响应最低，最高峰响应小于105 μV，不利于组分的鉴定分析，而所得峰面积和峰个数也显著小于固相微萃取法和热脱附法；固相微萃取法对轻组分的萃取效果较好，而对重组分萃取效果较差，色谱图在30 min以后基本没有出峰，且固相微萃取法由于其纤维萃取头对挥发性组分的吸附具有特异选择性，并不能全面反映样品的挥发性成分组成；而热脱附法在总峰面积和总峰个数上的提取效果均优于其他三种方法，并操作简单，重复性好，提取所得的微量易挥发组分较多，能够真实地反映样品挥发性成分的构成。因而，选择热脱附法作为橄榄油风味成分的提取方法。

表2 不同提取方法对萃取效果的影响

2.2 热脱附参数优化

对热脱附参数的优化主要采用经气相色谱分析得到的总峰面积及总峰面积与峰数的比值。总峰面积是由一些主要峰决定的,可以反映不同条件下主要峰的变化情况。总峰面积与峰数的比值能反映出萃取条件对所检测到的峰数的影响,使优化过程能对那些量少的成分负责[18]。

2.2.1 吸附温度

吸附温度优化结果显示(见图1)，吸附温度对样品的吸附效率有很大影响，吸附温度较低不利于香气物质的释放，但高的吸附温度会造成香气物质变化。吸附温度为40 ℃与30 ℃相比较，总峰面积及总峰面积与峰数的比值有所提高，但各化合物间的相对比例和主要香气物质基本一致。吸附温度为 90 ℃与40 ℃相比较：总峰面积和总峰面积与峰数的比值显著增高，但低分子量的醛类、醇类物质的相对含量有所降低，如正己醛在40 ℃时相对含量为19.022%，90 ℃时相对含量降低为1.693%；酯类、烯烃类、不饱和醛类物质的相对含量极速升高，如乙酸叶醇酯在40 ℃时相对含量为5.986%，90 ℃时相对含量升至12.400%；各化合物间的相对比例发生了改变，使主要香气成分也发生了改变，可能过高的吸附温度使挥发性组分发生了酯化反应和羟醛缩合反应，有待进一步确定。从检测的效率以及检测结果的全面性上考虑,宜采用40 ℃作为较佳的吸附温度。此外，40 ℃接近人体体温,测定的橄榄油样品中挥发性组分的表现与其在人体感官系统中的表现有一致性。

图1 吸附温度对测定结果的影响

2.2.2 吸附时间

为了考察吸附时间对样品挥发性组分富集的影响，本实验选择吸附时间0.5 h、1 h、2 h、3 h进行优化。从图2可看出,随着吸附时间的延长,吸附效果明显提高。在0.5～2 h之间,总峰面积和总峰面积与峰数比值变化极显著(P<0.01)。但在2～3 h,总峰面积及总峰面积与峰数比值基本持平,二者均在2h时达到最大值,之后保持不变,说明吸附剂在2 h便能吸附饱和。通过对色谱图的分析,发现增加的峰大部分出现于保留时间24 min后,可能是由于这些物质具有较高的沸点,如果萃取时间太短,它们将来不及挥发而不被吸附,因此一定长的吸附时间对于它们显得更为重要。大部分主要挥发物峰面积随吸附时间的变化规律与总峰面积的变化规律一致,但有的比总峰面积达到稳定所需的时间短,如正己醛。综合考虑,选择吸附时间2 h为宜。

图2 吸附时间对测定结果的影响

2.2.3 解吸温度和解吸时间

解吸温度及时间的选择直接关系着被吸附物质从样品管和冷阱管解析的程度。解吸温度如果过低可导致目标化合物的解析不完全，不仅会影响方法的灵敏性,而且会污染后续样品；如果温度过高可导致吸附剂变性，减少使用寿命，影响吸附效果。在解吸温度确定的条件下，解吸时间的长短决定了样品解析是否完全、分析的准确度和灵敏度。本实验对解吸温度和解吸时间的考察方法为：在其他参数不变的情况下，改变解吸温度或解吸时间参数进样时，样品管(样品)后紧接已老化的空白采样管(空白)，以公式：解析效率=样品峰面积/(样品峰面积+空白峰面积)×100%计算解析效率。综合考虑检测效率和检测成本，确定较佳的参数为一级解吸温度180 ℃；一级解吸时间5 min；二级解吸温度280 ℃；二级解吸时间8 min。冷阱温度是热脱附冷阱聚焦功能的一个关键参数，冷阱低温吸附并瞬间升温解吸，降低了系统误差，提高了分析的灵敏度，改善了谱带展宽问题，在仪器条件允许范围内，采用-30 ℃的冷阱温度进行分析。

注：图中峰号与表3的一致。

2.3不同品种油橄榄的初榨橄榄油中挥发性风味成分分析

按照优化后的热脱附条件对初榨橄榄油挥发性成分进行GC-MS分离鉴定，得到初榨橄榄油香气成分的总离子流图(见图3)。GC-MS谱图利用NIST 11

表3 初榨橄榄油的挥发性风味成分鉴定结果及相对含量

标准谱库检索对挥发性组分进行初步定性，然后用MassworksTM质谱解析软件对GC- MS谱图进行校正，测定各组分的模拟精准分子量，结合相关文献，对橄榄油挥发性组分进一步鉴定，最终得到橄榄油挥发性组分的定性结果，见表3。在11个初榨橄榄油样品的香气中共分离鉴定出22种化合物，按官能团的不同可以分为5大类物质，分别为：醇类(4.903%～32.424%)、醛类(20.476%～75.902%)、酯类(0.947%～13.769%)、酮类(1.905%～7.166%)、烯烃类(0.989%～11.981%),见图4。

由表3可知，1号瓦耶霍特级初榨橄榄油分离鉴定出23种挥发性化合物，其中相对含量较高的组分

图4 初榨橄榄油的挥发性风味成分分析

有乙酸叶醇酯(12.174%)、叶醇(12.095%)、反-2-己烯醛(10.012%)、1-十三烯(8.751%)；2号伯爵特级初榨橄榄油分离出24种，其中相对含量较高的组分有反-2-己烯醛(20.87%)、乙酸叶醇酯(10.849%)、叶醇(10.040%)、正己醛(7.936%)；3号太平之选特级初榨橄榄油分离出22种，其中相对含量较高的组分有反-2-己烯醛(17.114%)、叶醇(12.411%)、正己醇(10.325%)、反-2-己稀-1-醇(7.164%)；4号帆船牌特级初榨橄榄油分离出18种，其中相对含量较高的组分有反-2-己烯醛(38.862%)、正己醛(13.453%)、3-戊酮(5.381%)、正己醇(5.067%)；5号得科特级初榨橄榄油分离出20种，其中相对含量较高的组分有反-2-己烯醛(44.335%)、反-2-己稀-1-醇(8.303%)、叶醇(6.777%)、乙酸叶醇酯(6.620%)；6号卡拉佩利混合橄榄油分离出14种，其中相对含量较高的组分有正己醛(25.560%)、反-2-己烯醛(17.181%)、正己醇(7.101%)、反-2-己稀-1-醇(5.792%)；7号卡拉佩利特级初榨橄榄油分离出22种，其中相对含量较高的组分有反-2-己烯醛(29.107%)、乙酸叶醇酯(10.938%)、正己醛(10.596%)、叶醇(7.976%)；8号巴基斯坦特级初榨橄榄油分离出21种，其中相对含量较高的组分有反-2-己烯醛(23.737%)、正己醇(11.035%)、反-2-己稀-1-醇(7.021%)、柠檬烯(6.399%)；9号PATEROMIIICHELAKIS特级初榨橄榄油分离出23种，其中相对含量较高的组分有反-2-己烯醛(35.052%)、正己醛(19.022%)、乙酸叶醇酯(5.986%)、反-2-己稀-1-醇(4.881%)、；10号叙利亚特级初榨橄榄油分离出21种，其中相对含量较高的组分有正己醛(38.341%)、反-2-己烯醛(27.830%)、壬醛(3.087%)；11号祥宇特级初榨橄榄油分离出21种，其中相对含量较高的组分有反-2-己烯醛(53.772%)、正己醛(8.575%)、叶醇(4.648%)、正己醇(4.047%)。

2.3.1 醇类化合物及风味

有8种醇类物质被识别出来，主要为C5和C6的化合物，这些化合物对初榨橄榄油的气味特征有积极的贡献[19]。在11种初榨橄榄油中相对含量较高的有叶醇(0.875%～12.411%)呈新鲜草叶的清香和苹果青香、正己醇(0.425%～11.035%)有水果香气及芬芳的风味、反-2-己烯-1-醇(1.474%～8.303%)呈清香型；此外，除1号瓦耶霍特级初榨橄榄油、4号帆船牌特级初榨橄榄油、6号卡拉佩利混合橄榄油、8号巴基斯坦特级初榨橄榄油外，其他7种初榨橄榄油中相对含量较高的还有1-戊烯-3-醇(1.246%～2.168%)呈水果香；1号瓦耶霍特级初榨橄榄油和6号卡拉佩利混合橄榄油中相对含量较高的有2-乙基己醇(2.791%～3.298%)，具有甜味和淡淡的花香，其他各醇类物质的含量相对较低。从文献中得知，这些醇类化合物主要通过脂氧合酶途径合成，包括酶的氧化、裂解(过氧化氢酶)；又通过醇脱氢的作用减少(醇脱氢酶)，由于叶醇需要较低的的脂肪氧合酶的活性，故其相对含量较高[20]。

2.3.2 醛类化合物及风味

8种醛类物质被鉴定出来，主要为C6、C7～C9的醛，而C6的醛则是对初榨橄榄油的气味特征贡献最大的物质[21]。C6的醛中反-2-己烯醛(10.012%～53.772%)、正己醛(5.323%～38.340%)在11种初榨橄榄油中相对含量较高，是初榨橄榄油水果香、青草香的主要贡献者。其中，反-2-己烯醛则是相对含量最高的物质，应是初榨橄榄油中的主体香气成分。反-2-己烯醛除通过脂氧合酶途径产生外，还可经不稳定的反-3-己烯醛快速异构化为较稳定的反-2-己烯醛[20]。除4号、5号、7号、11号橄榄油外，其他7种初榨橄榄油中相对含量较高的还有壬醛(1.100%～3.349%)具有脂肪和柑橘的风味；4号相对含量较高的有Z-2-庚烯醛(1.993%)。6号相对含量较高的有辛醛(2.267%)、Z-2-庚烯醛(2.118%)，而同样是意大利橄榄油的5号和7号中相对较低，甚至未检出；此外6号橄榄油中未检出2-己烯醛，其他10种橄榄油中均有检出。辛醛在5号和11号橄榄油中未检出，其他9种橄榄油中均有检出；(E,E)-2,4-己二烯醛在1号、2号及6号橄榄油中未检出，其他8种均有检出。由上述分析可知：4个西班牙品牌(1～4号)中，4号主香气成分反-2-己烯醛相对含量明显高于其他三种；3个意大利品牌(5～7号)中，6号卡拉佩利混合橄榄油与5号、7号特级初榨橄榄油的醛类物质相对含量明显有差异。醛的形成可以通过影响醇脱氢酶的活性进而进一步加快醇的分解，因此，醛在一定程度上可抑制醇的生成[22]。长链醛在所分析的样品中的含量较低，据文献报道这些化合物可被视为氧化标志物及样品品质良好的表征[23]。

2.3.3 酮类、酯类和烯烃类各化合物及风味

酮类、酯类和烯烃类各化合物也是初榨橄榄油挥发性组分中的重要组成成分。酮类主要为C5的酮，有3-戊酮(1.119%～5.381%)和1-戊烯-3-酮(nd～0.786%)，一般对橄榄油的气味具有积极的贡献，3号、4号、6号、8号、9号橄榄油中未鉴定出1-戊烯-3-酮。酮存在于初榨橄榄油的香气中其可能的原因是与果实中内源酶的活性相关[23]。酯类物质有乙酸己酯(nd～2.495%)和乙酸叶醇酯(0.681%～12.174%)两种，其含量相对较低，这可能是由油橄榄果的成熟度所引起的；虽然酯类物质含量低检测出的化合物少，但对初榨橄榄油的气味特征能够产生积极的影响，尤其对果香味这一属性有积极的影响。除了以上来自脂氧合酶途径的物质外，还有一些含量较低的烯烃类化合物，主要有柠檬烯(0.098%～1.678%)、Z-罗勒烯(0.560%～1.704%)和紫苏烯(nd～1.214%)，现有文献对这类物质的来源鲜有报道，故其来源需待进一步研究确定。

综合分析可知，不同国家(西班牙、意大利、巴基斯坦、希腊、叙利亚、中国)的初榨橄榄油挥发性组分存在差异；同一国家(西班牙1～4号)的初榨橄榄油挥发性组分存在差异；同一国家不同等级橄榄油(意大利5号、6号)挥发性组分存在差异。初榨橄榄油挥发性组分很大程度上取决于油橄榄品种和产地，此外加工工艺不同也可能是造成挥发性组分差异的原因，有待进一步确定分析。

3 结论

3.1 热脱附法相较于液液萃取法、顶空法及固相微萃取法，因其提取效果好，操作简单，重复性好，对橄榄油中小分子、易挥发的微量成分不会造成破坏等优点，能够更真实地反映样品挥发性成分的构成，更适用于橄榄油挥发性风味成分的提取分析。

3.2 优化后橄榄油风味成分分析的热脱附参数为：吸附温度40 ℃；吸附时间2 h；一级解吸温度180 ℃；一级解吸时间5 min；二级解吸温度280 ℃；二级解吸时间8 min；冷阱温度-30 ℃。热脱附技术用于橄榄油香气成分分析操作简单，浓缩富集效率高，重现性好，其特有的冷阱聚焦功能，有效的改善了谱带展宽的问题，提高了检测的灵敏度，并通过两级解吸充分释放香气成分，真实全面地反映了橄榄油香气成分的构成。

3.3 TD-GC/MS法结合MassworksTM质谱解析软件共鉴定出橄榄油挥发性成分26种，有醇类、醛类、酯类、酮类、烃类，协同作用共同体现出橄榄油特征性风味。经过分析得知，不同国家的初榨橄榄油挥发性组分存在差异；同一国家的初榨橄榄油挥发性组分存在差异；同一国家不同等级橄榄油挥发性组分存在差异。