荠菜生长素极性运输基因1(CbPIN1)的克隆与表达分析

刘晓柱，李银凤

(贵州理工学院，贵州 贵阳 550003)

生长素(Auxin)是英国科学家达尔文(Darwin)父子发现的一种植物激素[1]。1928年荷兰科学家温特(Went)将其命名为生长素[2]。生长素在细胞水平调控细胞伸长、分裂与分化[3-6]；在植物个体水平，生长素调控器官建构、果实发育、植物衰老等多种生命过程[7-9]。生长素通过极性运输实现在植物体内的差异分布[8]。

PIN家族是目前公认的一种生长素输出载体，细胞膜上呈现极性分布，将生长素由细胞内运输到细胞，因而调节着生长素浓度梯度的动态平衡[10-11]。PIN1、PIN2、PIN3、PIN4 、PIN7 等基因已先后从拟南芥或其他物种中分离出, 并发现这些基因参与调控器官建构、根的伸长、向地性、胚胎发育等过程[12-13]。

荠菜(Capsellabursa-pastoris)，十字花科草本植物，营养价值丰富，同时还具有较高的药用价值，属药食同源植物[14]。另外，荠菜还是一种研究果实形态建成的模式植物。前期研究发现，生长素在荠菜心皮发育过程中起重要调控作用，同时生长素极性运输基因PIN3在荠菜果实生长素的侧向运输中起着关键作用[15]。PIN1作为生长素极性运输家族的重要一员，其在荠菜器官发育中的作用还未知。因此，笔者根据GenBank中拟南芥PIN1氨基酸序列，设计同源引物，通过RT-PCR技术，克隆了荠菜PIN1基因编码区cDNA序列，并进行了序列生物信息学分析。同时，分析了PIN1在拟南芥原生质体中的定位以及在荠菜组织中的表达特性。此外，对PIN1蛋白进行了原核表达，还构建了植物过表达载体，获得了转基因植株，为进一步研究PIN1在荠菜器官发育中的作用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试荠菜品种为野生型荠菜。供试拟南芥品种为Col-0，种子经氯酸钠表面消毒，无菌水冲洗后，铺于MS培养基上，4 ℃春化2 d，生化恒温光照培养箱中培养10 d。将幼苗转移到基质中(营养土∶蛭石=1∶1)，生长条件为22 ℃，12 h/12 h光照/黑暗，培养21 d叶片用于制备原生质体。

大肠杆菌DH5α；质粒pSAT6-YFP、pBI121均由湖南农业大学保存，PMD18-T载体购自TaKaRa公司。

甘油、琼脂粉、各种抗生素、MS粉等购自上海生工生物有限公司；植物总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、各种限制性内切酶、dNTPs、普通/高保真TaqDNA聚合酶、DNA连接酶等购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 荠菜CbPIN1基因的克隆 严格按照试剂盒说明书提取荠菜叶片总RNA，甲醛变性胶电泳与核酸紫外分光光度计法分析检测提取的RNA质量与浓度，然后采用反转录试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA。荠菜PIN1基因克隆引物的设计参考GenBank中拟南芥PIN1基因(NM_106017.4)序列进行(表1)。

将反转录的荠菜cDNA用于PCR反应，反应体系为：1 μL cDNA模板，2.5 μL PCR Buffer(10×)，1 μL dNTPs (10 μmol/L)，1 μLCbPIN1-C-F (10 μmol/L)，1 μLCbPIN1-C-R (10 μmol/L)，2 UTaqDNA聚合酶，补水至总体积25 μL。PCR反应程序为: 95 ℃，3 min; 94 ℃，1 min,55 ℃，1 min,72 ℃，2 min,35个循环；72 ℃，10 min。纯化试剂盒纯化PCR产物，连接至T载体后转化至DH5α感受态细胞中，含IPTG和X-gal的氨苄青霉素LB培养基上筛选转化子。试剂盒法小提白色克隆所含质粒，双酶切法检测并送测序进行分析。

1.2.2 荠菜CbPIN1生物信息学分析CbPIN1基因核酸序列同源性采用Blast法进行分析；CbPIN1开放阅读框的查找和翻译、氨基酸序列组成特点以及理化性质分析利用DNAStar软件进行分析；CbPIN1蛋白结构特征采用蛋白质分析系统(http://www.expsy/ch/tools)进行分析；CbPIN1蛋白系统进化树采用ClustalX 1.8与MEGA 5.0软件进行构建。

1.2.3 荠菜CbPIN1亚细胞定位 扩增CbPIN1全长cDNA，PCR纯化产物、pSAT6-YFP载体经XhoⅠ和EcoRⅠ酶切后，进行连接反应，构建35Spro-CbPIN1-YFP重组分子。分离制备拟南芥叶片原生质体，PEG介导法将35Spro-CbPIN1-YFP导入原生质体中进行瞬时表达。激光共聚焦显微镜测定YFP荧光。引物序列见表1。

1.2.4 荠菜CbPIN1组织表达分析 分别提取荠菜根、茎、叶、花、种子部位总RNA并将其反转录成cDNA。β-actin为内参，实时荧光定量PCR(q-PCR)方法分析CbPIN1基因表达水平。采用Roche Lightcycler 480系统扩增CbPIN1基因。扩增体系：2 μL cDNA，0.8 μLCbPIN1-T-F，0.8 μLCbPIN1-T-R，10 μL SYBR Green Mix(2×)，补水至总体积20 μL。扩增程序：95 ℃，3 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，72 ℃，10 min。CbPIN1相对表达量的分析按照2-ΔΔCt方法进行。

1.2.5 荠菜PIN1蛋白原核表达 扩增CbPIN1全长cDNA，采用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切PCR纯化产物和pMal-p2X载体，构建重组DNA分子pMal-p2X-CbPIN1。含重组DNA分子的大肠杆菌经 IPTG (1.0 mmol/L)诱导6 h后，SDS-PAGE检测蛋白表达产物。

1.2.6 荠菜转化pBI121-CbPIN1 扩增CbPIN1全长cDNA，Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切纯化的PCR产物和载体pBI121，16 ℃过夜连接反应，连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布在含卡纳霉素的LB培养基上，挑选抗性克隆，抽提质粒，双酶切检测后送测序。测序正确的重组质粒可用于后续植物转基因研究。引物序列见表1。

构建好的重组载体pBI21-CbPIN1转化至根癌农杆菌GV3101中，菌落PCR检测分析。当野生型荠菜主花序10 cm左右，次花序在莲座开始形成时，剪掉已开花或将要开花的花苞，花絮浸渍法进行荠菜的遗传转化，转化植物培养至种子成熟，收取转基因荠菜种子进行下一步的筛选与检测分析。

表1 所用引物Tab.1 Primers used

注：下划线部分为酶切位点。

Note: The underlined characters were restriction enzyme cutting sites.

2 结果与分析

2.1 荠菜CbPIN1基因的克隆

提取21 d荠菜叶片总RNA并反转录成cDNA，以cDNA为模板，进行RT-PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳检测，获得了一条约2 000 bp大小条带(图1)。纯化PCR产物，进行序列测定，最终确定所克隆cDNA全长1 869 bp，C+G含量为49%。Blast比对结果显示，所克隆序列与拟南芥(Arabidopsisthaliana)PIN1高度同源，相似性高达93%，与毛白杨(Populustomentosa)、碎米芥(Cardaminehirsuta)、金鱼草(Antirrhinummajus)等植物中PIN1基因同源性均超过70%。因此，荠菜PIN1基因已被成功克隆，命名为CbPIN1，并提交至GenBank(登录号：JN051352.1)。

M.1 kb plus DNA 分子质量标准；1-2.PCR扩增结果。M.1 kb plus DNA ladder; 1-2. Result of PCR.

2.2 荠菜CbPIN1蛋白结构分析

利用DNAStar软件翻译结果显示，CbPIN1编码的氨基酸个数为622(图2)，蛋白分子量为67.05 ku，等电点为9.02。CbPIN1蛋白中包含49个碱性氨基酸(K、R)；42个酸性氨基酸(D、E)；241个疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)；157个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。在拟南芥中，生长素极性运输功能的发挥依赖于PIN组分关键位点的磷酸化修饰。因此，NetPhosBac 1.0 Server 在线预测了CbPIN1蛋白是否存在磷酸化修饰，发现12个丝氨酸磷酸化位点，1个苏氨酸磷酸化位点存在于CbPIN1蛋白中(图3)，这暗示磷酸化修饰可能也会影响CbPIN1蛋白功能的发挥。

图2 CbPIN1基因核苷酸序列及推测氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the CbPIN1

图3 CbPIN1蛋白的磷酸化位点预测Fig.3 Phosphorylation prediction of CbPIN1 protein

蛋白质二级结构在线预测结果表明：CbPIN1蛋白无规卷曲(Random coil(c))为56.91%；β-折叠(Extended strand(e))为25.08%；α-螺旋(Alpha helix (h))为18.01%。ChloroP 1.1 Server预测结果显示，CbPIN1蛋白信号肽切割位点在N端第1-73位氨基酸残基之间，成熟蛋白质为549个氨基酸。TMHMM Server V.2.0 World Wide Web Server预测结果显示，CbPIN1属于跨膜蛋白，N端具有5个跨膜区，C端具有4个跨膜区(图4)。

图4 CbPIN1蛋白跨膜区预测Fig.4 Prediction of transmembrane domain of CbPIN1 protein

2.3 荠菜CbPIN1蛋白系统进化分析

利用MEAG 5.1构建了PIN1系统进化树来分析CbPIN1蛋白的进化关系，发现在亲缘关系上荠菜PIN1与拟南芥PIN1最近，同属于进化树上的一支；与菠萝(Ananascomosus)PIN1(AcPIN1)亲缘关系最远(图5)。

进一步分析表明，荠菜PIN1蛋白与拟南芥PIN1蛋白结构同源性超过90%，二者的N端和C端包含保守的跨膜结构域。此外， CbPIN1与AtPIN1亲缘关系最近，属于进化树上的同一支；与AtPIN2关系也较近；与AtPIN6亲缘关系最远(图6)。

图5 CbPIN1蛋白系统进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis between CbPIN1 and other PIN1 proteins

2.4 荠菜CbPIN1亚细胞定位

首先，在线预测了CbPIN1亚细胞定位，结果显示，CbPIN1在细胞膜上进行表达(图7-A)。为进一步证实CbPIN1在细胞中的表达部位，构建了荠菜亚细胞定位载体35Spro-CbPIN1-YFP，PEG介导法将35Spro-CbPIN1-YFP载体转化至拟南芥原生质体细胞中，发现拟南芥原生质体细胞膜上可检测到YFP信号(图 7-B-E)，进一步证明CbPIN1 定位于细胞膜。

图6 PIN蛋白同源性分析Fig.6 Homologous analysis of PIN protein family

A.在线预测结果；B-E.原生质体瞬时表达结果(Bar=5 μm)。A.Prediction of subcellular location on line；B-E.Result of transient expression in the protoplasts (Bar=5 μm).

2.5 荠菜CbPIN1组织表达分析

为分析CbPIN1基因表达模式，q-PCR方法检测CbPIN1在荠菜不同组织部位的表达情况。结果显示，在荠菜根、茎、叶、花以及种子中CbPIN1基因均进行表达，但其表达量不同(图8)。荠菜根中CbPIN1基因表达量最高，茎、花以及叶、种子中表达量均显著低于根中的表达量。由此推测，CbPIN1可能参与调控荠菜在根、茎和叶的发育过程。

2.6 荠菜CbPIN1原核表达

为进一步分析CbPIN1蛋白表达情况，构建了原核表达载体pET-32a-CbPIN1，转化至大肠杆菌。CbPIN1蛋白推测为67.05 ku。pET-32a载体自身tag序列大概20 ku，则表达出来的蛋白质大小应为87.05 ku。pET-32a-CbPIN1经IPTG诱导，6 h后表达了预期蛋白条带(图9)。

2.7 荠菜过表达CbPIN1基因植株的获得

为进一步研究CbPIN1对荠菜生长发育的影响，构建了植物过表达载体pBI121-CbPIN1。重组载体双酶切反应，经琼脂糖凝胶电泳，可显示出载体与目的基因2个片段，大小均符合预期，表明载体构建成功(图10-A)。

图柱上的不同字母表示不同组间差异显著(P<0.05)。图10同。Different letters above the columns indicated significant differences among the different groups at 0.05 levels.The same as Fig.10.

植物过表达载体pBI121-CbPIN1经根癌农杆菌介导法转化野生型荠菜植株，经卡纳霉素检测与分子检测获得了5株转基因植株(图10-B、C)。荧光定量PCR方法检测其CbPIN1基因表达量，结果显示，过表达植株中CbPIN1 基因表达量显著增加(图10-D)。

图9 荠菜CbPIN1原核表达Fig.9 Prokaryotic expression of CbPIN1

A.pBI121-CbPIN1载体构建：1.空载体，2-3.重组载体双酶切结果；B.转基因植株卡纳霉素筛选；C.转基因植株分子检测：CK. pBI121-CbPIN1载体，1-5.转基因植株；D.荧光定量PCR检测转CbPIN1基因表达量。

A.Construction of plant expression vector pBI121-CbPIN1: 1.Empty vector, 2-3.Double restriction enzyme digestion of recombinant vector; B.Kanamycin screening of transgenetic seedlings; C.Molecular identification of transgenetic seedlings:CK.Plant expression vector pBI121-CbPIN1, 1-5. Transgenetic seedlings; D.DetectionCbPIN1 expression level using q-PCR method.

图10pBI121-CbPIN1载体构建与荠菜转基因植株的检测
Fig.10ConstructionofplantexpressionvectorpBI121-CbPIN1andtransgeneticseedlingsidentification

3 结论与讨论

生长素作为植物体内的一种重要激素，受到国内外学者的广泛关注，而作为生长素运输载体之一的PIN1，其自然也一直是植物学中研究的一个重点研究领域。在拟南芥、水稻、狗蔷薇、苹果、桑树等多种草本、木本植物中先后均被克隆出来，也做了相应的功能分析，发现均参与生长素的运输过程，调控植物根、果实等器官的发育过程。而荠菜作为一种药食同源的植物，也可作为一种模式植物，但其PIN1基因一直未被克隆，且功能还未知，因此，本研究根据拟南芥PIN1蛋白序列，同源克隆了荠菜PIN1基因编码区cDNA区域，结果发现，荠菜PIN1基因与拟南芥PIN1基因相似性高达93%。实质上，荠菜与拟南芥同属十字花科，二者在遗传背景和生理特性上都较为一致，因此，二者PIN1基因高度相似。另外CbPIN1与碎米芥(Cardaminehirsuta)、金鱼草(Antirrhinummajus)等多种植物PIN1基因同源性也超过70%。说明植物中PIN1基因较为保守，暗示其功能可能较类似。为进一步证明其功能，采用生物信息学的方法分析了CbPIN1蛋白结构特点。发现CbPIN1是一个跨膜蛋白，亚细胞定位结果证实其在细胞膜上表达，这与其可能发挥生长素的运输功能相一致。

Zhang等[16]研究发现，在拟南芥中PIN蛋白在发挥生长素的极性运输载体功能时，需要其特定结构域被磷酸化；Weller等[17]试验结果进一步证实拟南芥特定TPRXS(N/S)模体(Motifs)位点的磷酸化是PIN1发挥生长素极性运输的必要前提。因此，在线分析了CbPIN1磷酸化情况，结果表明，CbPIN1蛋白包含12个丝氨酸磷酸化位点，1个苏氨酸磷酸化位点，这暗示磷酸化修饰可能也会影响CbPIN1蛋白功能的发挥。另外，进一步分析发现CbPIN1磷酸化位点分布特点与其他植物PIN1磷酸化位点分布较为一致。

越来越多的研究结果证实，PIN1在植物根(包括侧根、侧根原基、根尖等部位)的发育中发挥着重要的调控作用[18-20]。通过荠菜PIN1组织表达分析显示，CbPIN1在荠菜根中表达水平最高，这暗示了CbPIN1也可能参与调控荠菜根的生长发育过程。此外，在茎、叶、花等部位CbPIN1也存在表达，但其表达量显著低于根中的表达量，推测其CbPIN1基因可能参与调控这些器官的建构过程。

本研究通过同源克隆的方法获得了CbPIN1 cDNA编码区，生物信息学预测了蛋白结构特点；对CbPIN1进行了基因亚细胞定位、组织表达分析以及原核表达，另外，构建了植物过表达载体，获得了转基因荠菜，结果显示，CbPIN1表达量均显著增加。因此，本研究对荠菜PIN1基因做了初步分析，为进一步研究荠菜PIN1功能奠定了基础，同时也丰富与完善了植物PIN1。