星点东方鲀胚胎发育的观察

孙朝徽，姜秀凤，张红涛，赵雅贤，任玉芹，周 勤

(中国水产科学研究院北戴河中心实验站, 河北秦皇岛 066100)

星点东方鲀(Takifuguniphobles)，俗称龟鱼、蜡头、花龟鱼等，属鲀形目，鲀科，东方鲀属。分布于太平洋西岸的日本、韩国和我国从渤海到南海的广泛海域[1-3]。成鱼全长约10～17cm，是东方鲀属中生物个体最小的品种[4]。

星点东方鲀有着独特、严格的半月周期性繁殖习性，这种有规律和易观察的自然产卵行为为开展相关研究提供了极大便利[5-6]，因此星点东方鲀也成为了鱼类繁殖行为学研究的模式种。日本利用星点东方鲀开展了海水鱼生物学相关的系列研究：生殖周期中相关基因的表达研究[7]；河鲀毒素(tetrodotoxin, TTX)的相关研究[8-9]；HAMASAKI等[10]通过冷休克诱导不育3倍体制备鱼类生殖细胞移植受体的研究；河鲀由于在脊椎动物中具有最小的基因组而被做为比较基因组学的模式生物[11-12]。紧凑的红鳍东方鲀(Takifugurubripes)基因图谱帮助科学家解决了长期以来对人类基因数量估计的争论，并且发掘了近千个人类新基因[13-14]。星点东方鲀与红鳍东方鲀亲缘关系很近, 它们之间的杂交后代成活可育[4]；而相比红鳍东方鲀2 kg以上的成鱼体质量，星点东方鲀成鱼的维持成本大大降低；而且星点东方鲀成熟期短，繁殖力强，相比青鳉(Oryziaslatipes)、斑马鱼(Barchydanioreriovar)每次产卵几十粒，星点东方鲀每次的怀卵量在万粒以上；星点东方鲀有成熟的育苗程序，且实验材料容易获得；因此完全可以替代红鳍东方鲀用于脊椎动物基因组学研究[15]。小型硬骨鱼用作模式生物时，由于其易操作和具有透明的胚胎发生，长久以来被用于发育生物学、比较解剖学和生理学的研究[16-18]。目前以鱼类为模式生物的主要为小型淡水硬骨鱼，尚无海水硬骨鱼，星点东方鲀因具有上述优势，具备成为海水鱼模式生物的潜质。本研究对北戴河海域种群的星点东方鲀胚胎发育过程进行详细的观察,以期积累星点东方鲀的生物学基础资料, 为星点东方鲀作为海水鱼遗传生物学和鱼类行为学研究的实验动物提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 受精卵的获得

2015年6月15-18日，在北戴河老虎石海域收购128尾星点东方鲀亲鱼，体质量13.60～58.68g(平均为26.88 g)。此时，雄鱼大部分可以挤出精液。选取10尾体质量在20 g以上、可挤出精液的雄鱼，10尾体质量在25 g以上、体质强壮、腹部饱满的雌鱼，分别暂养在北戴河中心实验站良种场300 L玻璃钢水槽中，流水培养。6月19日，雌鱼按500 IU·kg-1体质量一次性注射人体绒毛膜促性腺激素HCG后轻挤亲鱼腹部，获得成熟卵子和精液，进行干法人工授精。

1.2 卵膜的去除

与其它同属品种类似，星点东方鲀受精卵为乳白色半透明粘性卵。为了便于观察其胚胎发育，按照MIYAKI等[19]的方法去除受精卵的粘膜。将受精卵放入10 L单宁酸溶液(0.05%)中浸泡30s后，用筛网收集清洗放入孵化水槽中。

1.3 胚胎发育观察

将去除粘膜的受精卵约1万粒放入300 L玻璃钢水槽中。以1～2 L· min-1的速率长流海水以控制水质、用电热棒(厦门海立方制冷设备有限公司， 钛合金2kW)控制水温在20.0～21.0℃。在受精后48 h内，连续观察，48 h后至孵化完成每1 h观察1次。观察时从孵化水槽用烧杯取卵，在解剖镜(LEICA M165 FC)下观察并拍照(LEICA DFC 450C)、记录。首次观察到出现形态特征的时间为划分胚胎发育分期时间点。在出膜前期，随机取100粒发育正常的受精卵置于500 mL烧杯中，将烧杯置于藻类培养器中，设置与孵化水槽同样的温度和光照条件。每1 h观察计数孵出的仔鱼，并确定不同时间点的孵化率。当50%的受精卵孵化时，确定为初孵仔鱼期。

1.4 形态学特征及分期

为详细描述星点东方鲀的胚胎发育，笔者参照暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)[20]和模式生物青鳉[21]、斑马鱼[22]的研究成果，确定了星点东方鲀胚胎发育的主要分期方案和形态学特征。

2 结果与分析

不同时期受精卵形态学特征如下：

2.1 卵间隙期(perivitelline space stage)

受精卵呈圆形粘性， 卵黄丰富，呈淡黄色。卵膜较薄， 半透明，卵径约为756 ～863 μm，平均(814±31)μm。含有大量小颗粒聚集在一起的油球块，直径约为卵径的一半。卵吸水后膨胀不明显， 形成的卵间隙较小， 约为0.018～ 0.038 mm。(图版Ⅰ-1)

2.2 胚盘形成期(blastodisc stage)

受精后, 动物极与植物极随即分化，原生质开始从植物极向动物极聚集，并集中在卵黄表面，形成隆起的胚盘。(图版Ⅰ-2)

2.3 2细胞期(2-cell)(1 h 40 min)

胚盘对等分裂为2个分裂球。(图版Ⅰ-3)

2.4 4细胞期(4-cell)(2 h 11 min)

第2次卵裂为经裂，与第1次分裂面相垂直，产生4个体积相等的分裂球。(图版Ⅰ-4)

2.5 8细胞期(8-cell)(2 h 43 min)

第3次卵裂形成2个卵裂面，都是经裂。与第2次卵裂面垂直，而与第1次卵裂面平行。第3次卵裂形成8个分裂球。(图版Ⅰ-5)

2.6 16细胞期(16-cell)(3 h 32 min)

第4次卵裂也有2个分裂面， 仍为经裂。图版Ⅰ-6可见清晰的4个分裂球，说明第4次分裂与第2次分裂面平行，位于两侧，分裂成16个分裂球。

2.7 32细胞期(32-cell)(4 h 17 min)

中部细胞形成2层，可观察到明显的边缘细胞。(图版Ⅰ-7)

2.8 64细胞期(64-cell)(5 h 9 min)

自32细胞期后，已经不能清楚追踪细胞分裂状况，图版Ⅰ-8根据发育分裂进程连续观察到由32细胞期到64细胞期过程。与斑马鱼相同，在512细胞期前均为同步1→2的均裂[17]。

2.9 多细胞期(multicellular stage)(5 h 44 min)

经过几次连续分裂， 分裂球的数量越来越多， 体积也越来越小。在卵黄囊上方的分裂球呈现多层。细胞界线仍然清晰可见。(图版Ⅰ-9)

2.10 桑椹期(morula stage)(6 h 42 min)

(图版Ⅰ-10)

2.11 高囊胚期(high blastula stage)(8 h 6 min)

卵裂已进行到后期，分裂球的数目越来越多， 越来越小，细胞界线变得模糊。由它们组成的囊胚层突出在卵黄之上，其高度约为卵径的1 /4。(图版Ⅰ-11)

2.12 低囊胚期(low blastula stage)(11 h 37 min)

囊胚层隆起变低，其高度约为卵径的1/5。边缘细胞开始下包，囊胚腔清晰可见。细胞大小不均(图版Ⅰ-12)。这一时期部分胚细胞(blastomeres)开始异步分裂[21]。

2.13 原肠早期(early blastula stage)(13 h 38 min)

沿卵黄囊向下延伸(下包，epiboly)的囊胚层细胞，由于卵黄的阻碍，有大量细胞积聚在囊胚层外周的边缘，形成胚环。胚环向植物极延伸下包达卵径的1/3。(图版Ⅰ-13)

2.14 原肠中期(middle gastrula stage)(16 h 13 min)

随着下包运动的进行，下包达卵径的1 /2以上。胚环继续增厚，十分清晰。出现胚盾。(图版Ⅰ-14)

2.15 原肠后期(later gastrula stage)(18 h 56 min)

胚层细胞下包达卵径的2 /3以上, 胚盾进一步增厚，且继续向植物极移动。出现清晰的胚孔。胚体雏形出现。(图版Ⅰ-15)。

2.16 神经胚期(neurula stage)(22 h 41 min)

胚层细胞下包达卵径的4 /5以上。胚环明显缩小， 卵黄大部分被包围。可观察到胚体背部有一由头部向后延伸的条状细胞体，为神经物质增厚凹陷形成的神经沟。(图版Ⅰ-16)

2.17 胚孔封闭期(blastopore close stage)(25 h 48 min)

胚孔逐渐缩小变得模糊，胚层合拢，胚孔封闭。(图版Ⅰ-17)

2.18 肌节出现期(somite stage)(28 h 43 min)

胚体中部出现1～3对肌节，胚体前端稍膨大隆起为头部。胚体匍匐在卵黄上，胚体环绕卵黄囊达2/3(图版Ⅰ-18)

2.19 眼基出现期(eye rudiment stage )(30 h 33 min)

在胚体头部两侧出现泡状结构为眼原基。肌节3～5对，胚体匍匐在卵黄上，围绕卵黄约3/4。(图版Ⅰ-19)

2.20 眼囊期(eye vesicle stage)(32 h 38 min)

头部之间的卵黄囊开始内陷呈椭圆形眼囊，胚体大为伸展，脑开始分化成前、中、后3个脑泡。(图版Ⅰ-20)

2.21 嗅板期(flat body stage)(36 h 11 min)

眼囊前下方出现一对近圆形的嗅板。肌节6～8对。(图版Ⅰ-21)

2.22 尾芽期(tail bud stage)(38 h 17 min)

胚体后端伸长并突起形成圆锥状尾芽与卵黄囊游离，脊索开始形成。肌节增至10～14对。(图版Ⅰ-22)

2.23 耳囊期(ear vesicle stage)(40 h 31 min)

后脑两侧出现椭圆形耳囊，其中尚无耳石。眼囊中央出现凹陷，并逐渐形成视杯。(图版Ⅰ-23)

2.24 晶体出现期(lens stage)(42 h 1 min)

视杯扩大，在视杯口出现圆形的晶体，尾尖偏向一边，明显与卵黄囊分离。肌节增至20～22对。胚体围绕卵黄囊约5/6。(图版Ⅰ-24)

2.25 肌肉效应期(motility stage)(49 h 40 min)

胚体中后部肌肉开始缓慢的、颤动式的收缩，每分钟5～8次。晶体已经非常清晰。(图版Ⅰ-25)

2.26 耳石形成期(otoliths stage)(53 h 31 min)

耳囊中出现2个黑色颗粒状耳石。胚体中部及卵黄囊上出现星芒状黑色素细胞(melanophores)。 (图版Ⅰ-26)

2.27 心脏原基期(heart anlage stage)(58 h 45 min)

胚体头部腹面和卵黄囊之间出现圆管状、中间略凹陷的心脏，心脏开始微弱博动。肌节增至24～30对。尚无血液循环。(图版Ⅰ-27)

2.28 血液循环期(blood circulation stage)(63 h 42 min)

血管在胚体中形成，可见零星的血细胞沿一定的路线缓缓移动。心脏跳动，每分钟25～68次。胚体围绕卵黄约1周。(图版Ⅰ-28)

2.29 眼色素形成期(retinal pigmentation stage)(70 h 5 min)

视网膜出现色素沉着， 眼部逐渐变成黑色，肉眼观察受精卵可见两个明显黑色眼点。胚体及卵黄囊黑色素细胞在增多。(图版Ⅰ-29)

2.30 胸鳍原基期(pectoral fin bud stage)(75 h 1 min)

耳囊下方出现圆扇形的胸鳍原基。胚体抽搐扭动更趋激烈，达到每分钟35次。尾尖达到胚体眼部。(图版Ⅰ-30)

2.31 出膜前期(pre-hatching stage)(88 h 36 min)

卵膜变薄变软。胚体在膜内由于尾部抽动发生旋转，血液循环清晰可见。(图版Ⅰ-31)

2.32 孵化期(hatching stage)(99 h 31 min)

由于胚体尾部剧烈摆动，卵膜破裂，仔鱼大部分为头部先出膜，部分尾部先行出膜。随着尾部摆动加剧，仔鱼的整个身体脱离卵膜。初孵仔鱼全长(2.10±0.03)mm。(图版Ⅰ-32)

2.33 初孵仔鱼(newly hatched larva)(108 h 31min)

当孵化率达到50%后，确定为整个孵化过程的结束。初孵仔鱼全长(2.57±0.11) mm。所有受精卵孵化完成约124 h。

3 讨论

3.1 卵径

星点东方鲀是东方鲀属内生物个体最小的鱼种。本实验中采用的北戴河种群，其受精卵卵径为756～863 μm，平均(814±31)μm，明显小于其它东方鲀属品种：暗纹东方鲀：1118～1274 μm ,[19]、弓斑东方鲀(T.flavidus)：(1485±41)μm[23]、红鳍东方鲀：1210～1300 μm[24]、菊黄东方鲀(T.flavidus)990～1010 μm[25]、豹纹东方鲀(T.pardalis)：(1310±30) μm、施氏东方鲀(T.snyderi)：(1000±20) μm、密点东方鲀(T.stictonotus)：(1090±20) μm[26]。而且小于日本星点东方鲀种群(870±20) μm[26]。星点东方鲀在我国沿海均有分布，对不同海域的种群进行形态学对比研究有助于丰富星点东方鲀的比较基因组学研究成果[3, 27-28]。

3.2 形态

本研究以暗纹东方鲀[20]为主要参照，结合模式生物鱼种----青鳉[20]和斑马鱼[21]的发育分期，初步建立了以形态学和组织器官发生为依据的星点东方鲀胚胎发育分期方案。对照暗纹东方鲀及青鳉时发现：1)在32-cell期观察到明显的边缘细胞(图版Ⅰ-7)，不同于莫永根等[20]研究的暗纹东方鲀在32-cell期全部为水平分裂，而与青鳉[21]相同，表现为仅中部的 4个细胞水平分裂形成两个胚层。2)星点东方鲀发育到肌节出现期(28 h 43 min)和晶体出现期(42 h 1 min)时，胚体环绕卵黄囊分别达2/3和5/6(图版Ⅰ-25)，明显快于暗纹东方鲀发育到晶体出现期(65 h 50 min)的2/3[20]和青鳉在胸鳍原基期时还不到2/3[21]。

3.3 发育进程

不同学者在记录时采用的时间点存在差异。本实验以首次观察到的形态指标来参照划分时间点，但孵化结束的时间点采用了与莫永根等[20]相同的标准，即：所观察样本中有50%表现出相应发育期特征为时间点。胚胎发育分期采用的标准略有不同。在孵化水温均为20.0～21.0℃的条件下，孵化完成的时间为108 h 31 min，这个结果快于暗纹东方鲀(131 h 15 min)[20]；孵化仔鱼开始出现的时间点(99 h 31min)快于红鳍东方鲀(145 h)(孵化水温：19.2℃)[29]；特别要指出的，也大大快于日本星点东方鲀种群(144 h)(孵化水温：20.0～23.0℃)[26]。

图版-Ⅰ 星点东方鲀胚胎发育各时期形态
Plate.Ⅰ Morphological features of embryonic development stages ofTakifuguniphobles
注：b: 囊胚腔; bd: 胚盘; bm: 分裂球; bp: 胚孔; bv: 脑泡 ; ch：绒毛膜; er: 眼基; em, 胚体; es: 胚盾; eve: 耳囊; ev: 眼囊; gr: 胚环; ha:心脏原基; l: 晶体; mc：边缘细胞; ml: 黑色素细胞； od: 油球; ot: 耳石; pa: 原生质聚集; pf: 胸鳍； ps: 卵周隙; sm: 体节; tb: 尾芽；标尺=200μm
1. 卵间隙期; 2. 胚盘形成期; 3. 2细胞期; 4. 4细胞期; 5. 8细胞期; 6. 16细胞期; 7. 32细胞期; 8. 64细胞期; 9. 多细胞期; 10. 桑椹期; 11. 高囊胚期; 12. 低囊胚期; 13. 原肠早期; 14. 原肠中期; 15. 原肠后期; 16. 神经胚期; 17. 胚孔封闭期; 18. 肌节出现期; 19. 眼基出现期; 20. 眼囊期; 21. 嗅板期; 22. 尾芽期; 23. 耳囊期; 24. 晶体出现期; 25. 肌肉效应期; 26. 耳石形成期; 27. 心脏原基期; 28. 血液循环期; 29. 眼黑色素形成期; 30. 胸鳍原基期; 31. 出膜前期; 32. 孵化期; 33. 50%孵化期

Notes: b: blastocele; bd: blastodisc; bm: blastomeres; bp: blastopore; bv: brain vesicles ; ch：chorion; er: eye rudiment; em, embryonic body; es: embryonic shield; eve: ear vesicle; ev: eye vesicle; gr: germ ring; ha:heart rudiment; l: lens; mc：marginal cell; ml: melanophores； od: oil droplet; ot: otolith; pa: protoplasmic accumulation; pf: pectoral fins； ps: perivitelline space; sm: somite; tb: tail bud；bar=200μm

1. perivitelline space stage; 2. blastodisc stage; 3. 22-cell; 4. 4-cell; 5. 8-cell; 6. 16-cell; 7. 32-cell; 8. 64-cell; 9. multi-cell stage ; 10. morula stage; 11. high blastula stage; 12. low blastula stage; 13. Early blastula stage; 14. middle gastrula stage; 15. later gastrula stage; 16. neurula stage; 17. blastopore close stage; 18. somite stage; 19. eye rudiment stage; 20. eye vesicle stage; 21. flat body stage; 22. tail bud stage; 23. ear vesicle stage; 24. lens stage; 25. motility stage; 26. otolith emerge stage; 27. heart anlage stage; 28. blood circulation stage; 29. retinal pigmentation stage; 30. dorsal fin bud stage; 31. pre-hatching stage; 32. hatching stage; 33. 50% hatched