温度和光照强度对多肋藻(Costaria costata)配子体生长影响研究

孙 娟，潘金华，张壮志，李 霞，赵 楠，梁广津，史 良，姜黎明，曲艳艳，罗世菊，李晓捷

(山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台 264003)

多肋藻(Costariacostata)是一种具有较高经济价值的大型褐藻，属于海带目(Laminariales)、海带科(Laminariaceae)，是多肋藻属(Costaria)中唯一的一个种[1]。多肋藻自然资源主要分布在北太平洋沿岸潮间带或者潮下带浅海区域，其中朝鲜半岛东北沿海、日本北海道及本土、俄罗斯远东的鄂霍次克海、大彼得湾均有分布[2-5]。多肋藻藻体叶片具有5条纵向分布的“肋”，在日本被称为“筋布”，富含碘和多种人体必需微量元素，具有较高营养价值和悠久的食用历史[1，6]。由学策等[7]在室温条件下跟踪观测了多肋藻配子体生长状况以及孢子体育苗后幼苗生长情况，为室温条件下多肋藻育苗提供了重要参考；Fu等[8]和梁广津等[9]分别采用孢子体育苗和配子体育苗技术完成多肋藻育苗并进行海区栽培试验，藻体长度分别达到194.0和228.3 cm。李苗苗等[10]提取了多肋藻多糖并对其理化性质进行了分析，表明多肋藻中多糖主要为褐藻胶和2种结构复杂的褐藻糖胶，是一种多糖含量丰富的优良藻种。李鸶鸶等[11]优化了多肋藻岩藻聚糖硫酸酯的提取工艺并对其降血脂作用进行了研究，结果显示多肋藻岩藻聚糖硫酸酯粗提物对小鼠血清总胆固醇、血清甘油三酯和低密度脂蛋白均具有显著的抑制作用。多肋藻作为一种优良的大型经济褐藻，其商业化开发利用具有重要的价值和意义，开发其配子体快速扩增培养技术，对采用配子体进行多肋藻苗种繁育，提高苗种繁育效率并对多肋藻大规模产业栽培和开发也具有重要的支撑作用。本文以多肋藻配子体为研究对象，通过设定不同温度和光照强度条件研究多肋藻配子体适宜生长条件，以期为多肋藻配子体规模化扩增培养提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验中采用的多肋藻配子体，取自国家海藻与海参工程技术研究中心种质库。

1.2 试验方法

将多肋藻雌、雄配子体磨碎，分装进入培养皿内(φ 9 cm)，转入光照培养箱(10℃和1 000 lx)进行恢复培养1周，然后将恢复培养之后装有多肋藻配子体的培养皿分别转入温度8、12、15、20、23℃光照培养箱内，每个温度条件下设置500、1 000、2 000、3 000、4 000 lx共5个光照强度条件。雌、雄配子体分别进行相同温度和光照条件的试验。每周镜检配子体状态，经过4周培养之后，拍照(Olympus IX51)，并采用Image-pro进行数据统计。每个试验条件设3个培养皿，每个培养皿测量10个数据，即每个试验条件共测量30个数据(n=30)。根据初始配子体平均长度(L0)和试验结束时的配子体平均总长度(L1)计算相对生长速率(RGR，%·d-1)，计算公式RGR=100·[ln(L1)-ln(L0)]/t，其中t为试验天数(d)。

1.3 统计分析

采用双因素方差分析检验温度和光照条件对多肋藻配子体生长的影响，相同温度条件下进行单因素方差分析并采用LSD进行差异显著性分析。Leven’s-test进行方差齐性检验，必要时进行数据转化。显著水平设为P<0.05。所有统计分析均在SPSS 17.0软件内完成。

2 结果

2.1 温度8℃条件下多肋藻雌、雄配子体生长情况

在8℃条件下，只有当光照强度为500 lx时，多肋藻雌配子体才生长，至试验结束时，配子体平均总长度由81.27 μm生长至214.72 μm，相对生长速率约3.05%；在所设置的其它光照强度下几乎全部萎缩、衰亡，无法正常存活。而雄配子体在500 lx生长最快，配子体平均总长度由77.63 μm生长至6 022.80 μm，相对生长速率约14.42%，生长速度显著大于其他光照组(P<0.05)(图1和图2)。

2.2 温度12℃条件下多肋藻雌、雄配子体生长情况

在12℃条件下，多肋藻雌配子体在1 000 lx时生长最快，至试验结束时，配子体平均总长度由81.27 μm生长至1 040.33 μm，相对生长速率约8.73%，生长速度显著大于其他光照组(P<0.05)。而雄配子体在500 lx生长最快，配子体平均总长度由77.63 μm生长至3 387.07 μm，相对生长速率约12.97%，生长速度与1 000 lx试验组差异不显著，但显著大于其他光照组(P<0.05)(图3和图4)。

2.3 温度15℃条件下多肋藻雌、雄配子体生长情况

在15℃条件下，多肋藻雌配子体在500 lx时生长最快，至试验结束时，配子体平均总长度由81.27 μm生长至8 813.40 μm，相对生长速率约16.04%，生长速度显著大于其他光照组(P<0.05)。而雄配子体在2 000 lx生长最快，配子体平均总长度由77.63 μm生长至8 322.13 μm，相对生长速率约16.10%，生长速度显著大于其他光照组(P<0.05)(图5和图6)。

2.4 温度20℃条件下多肋藻雌、雄配子体生长情况

在20℃条件下，多肋藻雌配子体在1 000 lx时生长最快，至试验结束时，配子体平均总长度由81.27 μm生长至10 234.07 μm，相对生长速率约16.58%，生长速度显著大于其他光照组(P<0.05)。而雄配子体在2 000 lx生长最快，配子体平均总长度由77.63 μm生长至17 215.33 μm，相对生长速率约18.54%，生长速度与1 000 lx试验组差异不显著，但显著大于其他光照组(P<0.05)(图7和图8)。

2.5 温度23℃条件下多肋藻雌、雄配子体生长情况

在23℃条件下，多肋藻雌配子体在1 000 lx时生长最快，至试验结束时，配子体平均总长度由81.27 μm生长至7 865.67 μm，相对生长速率约15.82%，生长速度显著大于其他光照组(P<0.05)。而雄配子体在2 000 lx生长最快，配子体平均总长度由77.63 μm生长至15 206.83 μm，相对生长速率约18.20%，生长速度显著大于其他光照组(P<0.05)(图9和图10)。

3 讨论

20世纪70年代我国海藻遗传学家方宗熙发现人工培养条件下海带雌、雄配子体均可形成无性繁殖系(又称克隆系)并可以单独培养[12]，随后海带配子体低温、弱光保存培养技术获得突破，直到目前其仍为大规模种质保存的常用技术[13]，此后又先后开发了固相保存技术[14]和超低温冷冻保存技术[15]，海带配子体无性繁殖系逐步被广泛用于基础生物学研究以及海带杂交育种[16-17]。曾呈奎等[18]最早研究了培养温度对海带配子体生长发育的影响，发现15℃和10℃分别是海带配子体适宜生长和适宜发育的温度条件，李晓捷等[19]对901海带配子体的研究也得出相似结论，并且发现25℃是致死温度。本研究结果显示，在各试验温度条件下，多肋藻雄配子体生长速度要显著快于雌配子体，且随着培养温度升高，雄配子体的适应生长光照强度也显著高于雌配子体；多肋藻雌、雄配子体均在温度20℃条件下生长速度最快，这与王军等[20]对利尻海带配子体的研究得出的结论相似。

本文研究发现在8℃条件下，雌配子仅在500 lx下能够正常存活，但生长异常缓慢，而雄配子体则明显比雌配子体生长速度更快，且所有试验条件下均能存活，在其他温度条件下，相同光照强度条件下的雄配子体生长速度也大多快于雌配子体，证明多肋藻雄配子体抗逆性和适应性要显著强于雌配子体。在23℃条件下，多肋藻雌、雄配子体生长速度均出现明显下降，且发生配子体萎缩衰亡。培养温度是影响海带配子体生理指标的重要环境因素，高温处理对海带配子体存活率有显著影响，且存在配子体性别差异和品种差异，奔牛配子体在23℃进行不同时间的胁迫处理，结果显示处理4 d后配子体存活率仅为40%左右[21]。宣慧等[22]研究发现在20℃条件下，海带配子体的生长和各项生理指标与对照组15℃相比无明显变化，但在25℃条件下培养1 d后，叶绿素a含量逐渐下降；而在28℃和30℃条件下培养1 d后，细胞色素萎缩分解并随后大量死亡。因此，多肋藻配子体的培养温度应该严格控制在23℃以下，最好能保持在20℃以内。对于雌性配子体培养，光照强度保持在1 000 lx左右为宜；雄性配子体培养，光照强度保持在2 000 lx左右为宜。