海胆性腺冷藏贮藏过程中磷脂的变化

尤海琳，姜 璐，刘锴锴，宫 璇，郭梦雪，迪力努尔·吐尔逊，胡建恩，卢 航

(大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连 116023)

磷脂是一类广泛存在于自然界中的含磷脂质，是生物膜的重要组成部分，也是构成生命的物质基础之一[1]。因磷脂丰富的生理活性，使得其在食品、保健品、医药以及饲料行业中备受关注[2-3]。海洋磷脂是指来源于海洋生物的磷脂，其基本特征是Sn-2上的脂肪酸由多不饱和脂肪酸组成[4-6]，如二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)，因此表现出更为优越的生理活性，比如更好的抗氧化性[7]、抗炎、降血脂、稳定性等[8]，其营养价值引起人们极大关注[9-11]。

海胆性腺，俗称海胆黄，是海胆中唯一可食用部分。目前，海胆的食用方式主要以鲜食为主，在市场上有两种流通形式：一种为冰鲜水袋海胆，即将新鲜的海胆生殖腺置于盐水水袋中，封口冰鲜保存；另一种为冰鲜摆盒海胆，即将鲜海胆生殖腺摆放在包装盒中冰鲜保存。海胆性腺中脂质含量丰富，约占湿重的4.43%[12]，主要由甘油三酯、磷脂及少量糖脂等物质组成，其中脂肪酸多由多不饱和脂肪酸组成，如在紫海胆中检出其含有30多种脂肪酸，其中ω-6系列不饱和脂肪酸∶ω-3系列不饱和脂肪酸的比值高达0.71[13]，因而海胆性腺具有较高的食用价值和药用功能。然而，由于磷脂中多不饱和脂肪酸含量较高，易受温度、酶、氧气等因素的影响，因此在贮运过程中极易发生氧化及水解，从而影响产品的品质风味及营养价值。目前，国内外对海产磷脂的研究报道不多，王昕岑研究发现小黄鱼肌肉、睾丸和肝脏中磷脂在4℃条件下贮存5 d后，其含量均呈现下降趋势[14]；王晓旭等研究凡纳滨对虾磷脂水解机理发现，贮藏中卵磷脂变化主要是磷脂酶A2催化水解反应，其水解产物主要为游离脂肪酸和溶血卵磷脂[15]；杨文鸽等研究发现马面鲀卵巢中磷脂在不同温度下贮藏3 d过程中，随着温度的升高磷脂酰胆碱所占的百分比快速下降，而溶血磷脂酰胆碱的比例有不同程度的增加[16]。因此本文以冰鲜摆盒海胆为原料，研究低温贮藏过程中海胆性腺磷脂的变化，旨在为冰鲜海胆食用提供理论依据及参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黄海胆(Glyptocidariscrenularis)性腺，由大连戴氏生物科技有限公司提供，在4℃条件下贮存72 h，每12 h取样一次，样品冻干处理。

1.2 实验方法

1.2.1 海胆性腺中总脂质的提取

采用修改后的Floch法进行总脂质提取。海胆性腺冻干后匀浆液以1∶10(m/v)的比例与氯仿-甲醇(2∶1，v/v)溶液混合，搅拌后，静置10 min抽滤，收集滤液，滤渣再次重复两次上述操作。将上述所得滤液合并至分液漏斗中，加入1/5滤液体积的0.9% NaCl溶液，振荡摇匀后静置过夜分层，收集下层氯仿层，于45℃下真空旋蒸至干，氮气吹干旋蒸瓶中剩余水分，旋蒸瓶中残余物即为海胆性腺总脂质。

1.2.2 海胆性腺脂质分析

采用硅胶柱层析的方法[17-19]：100 g硅胶湿法装柱，待柱子平衡过夜后，称取上述提取的海胆性腺总脂质约600 mg，用少量氯仿溶解后上样，分别依次用5倍柱体积的氯仿洗脱中性脂肪，三倍柱体积丙酮洗脱糖脂和色素(脂溶性色素)，再用2.5倍柱体积甲醇将磷脂洗脱下来，分别收集后旋蒸至干并称重，记录各部分重量。将磷脂溶于氯仿中，放于-20℃冰箱中保存。

1.2.3 海胆性腺中磷脂的定性定量分析

采用高效液相色谱法搭配蒸发光检测器(HPLC-ELSD)[3]，通过整体正相硅胶柱搭配正己烷-异丙醇-水体系，进行海胆性腺中磷脂定性定量分析。

准确称取适量硅胶柱层析海胆性腺磷脂样品，溶解于色谱级正己烷-异丙醇(3∶1，V∶V)混合液中，使用磁力搅拌器搅拌均匀。使用前用0.22 μm孔径的有机相滤膜过滤除杂，放于-20℃冰箱中保存备用。

使用日立LaChrom Elite系列高效液相色谱仪，搭配Alltech2000蒸发光散射检测器，Chromolith®Performance-Si型德国默克正相硅胶色谱柱(100 mm×4.6 mm)。采用三元梯度方式进行洗脱，其中流动相A为正己烷+三乙胺；流动相B为异丙醇(100%)；流动相C为13%冰乙酸。流动相的流速为1.5 mL/min，柱温箱温度为25℃。检测器采用分流模式，以空气作为雾化气，空气流速为1.7 L/min，漂移管温度45℃[3]。高效液相梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱流动相组成

注：a正己烷(含0.04%三乙胺)，b异丙醇(100%)，c13%乙酸。

Notes：aN-hexane(containing 0.04% triethylamine)，b2-propanol(100%)，c13% acetic acid glacial.

1.2.4 海胆性腺磷脂中脂肪酸的分析

使用岛津气相色谱仪对海胆性腺中磷脂进行脂肪酸分析。测定前先对样品进行甲酯化处理：准确称取10.0 mg的海胆磷脂样品，加入2 mL2% H2SO4/甲醇溶液，样品管中充入氮气，于80℃水浴加热1 h后取出，再依次加入1 mL蒸馏水和1 mL正己烷，涡旋震荡。静置分层后取上层正己烷氮气吹干，溶于100 μL正己烷中，使用前用0.22 μm孔径有机相滤膜过滤除杂。

采用FFAP柱(30 m×0.32 mm i.d.)为分析柱；进样口温度250℃，检测器温度260℃；采用程序升温方式，首先在50℃下保留1 min，以15℃/min升到100℃，再以5℃/min升到120℃，然后25℃/min升高到200℃保留6 min，最后3℃/min升高到220℃保留10 min，载气为高纯氮气，进样量1.0 μL。通过比较样品与标准品色谱图保留时间，确定脂肪酸甲酯的成分，对全部峰面积积分后利用面积归一化法得到各主要脂肪酸的相对百分组成。

2 结果与讨论

2.1 海胆性腺脂质在贮藏过程中的变化

通过柱层析分析海胆性腺脂质组成，结果如表2。

表2 海胆性腺贮藏过程中脂质组成变化

由表2可以看出，海胆性腺油脂中主要由中性脂肪(50%)、磷脂组成(46%)、糖脂+色素(7%)组成；随着贮藏时间延长，油脂中中性脂肪含量从50%上升至62%；糖脂+色素(脂溶性色素)含量升高至17%，其含量升高推测是因为贮存过程中一些与蛋白质结合的脂溶性色素氧化水解出来使其含量增多[17]；因磷脂脂肪酸侧链多由多不饱和脂肪酸组成，在贮存过程中极易发生氧化水解反应，使得磷脂含量不断下降，本实验中磷脂在72 h贮存中含量从46%降低到29%，说明海胆性腺中磷脂在贮藏过程中发生降解。因本实验采用硅胶柱层析法分析海胆性腺脂质组成，在旋干过程中存在有机试剂残留，使其脂质含量总和升高，存在实验误差。

2.2 海胆性腺磷脂在贮藏过程中的变化

2.2.1 磷脂测定方法建立

因在海洋磷脂中脑磷脂(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、鞘磷脂(SM)、卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)是含量较多的五种磷脂标准品，所以将其混合进样，结果如图1所示。

从图1可以看出，采用HPLC-ELSD方法，五种磷脂标准品均能达到基线分离，且峰形良好，成单峰，每次分析均能在15 min内完成，平衡9 min后进下一个样品。进而以磷脂浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，配制不同浓度梯度的磷脂标准品，建立标准曲线方程如表3。

表3 磷脂标准曲线方程

从表3可以看出ELSD的响应值与磷脂浓度线性相关，进而在此基础上作为磷脂定量的标准曲线对海胆性腺中各类磷脂进行定量分析。

2.2.2 海胆性腺磷脂贮藏过程中的变化

通过测定发现海胆性腺磷脂中主要含有PE、PI、PC三种磷脂，未检测到SM的存在，其中PC含量最高，约占总磷脂的36%，其次是PE约占总磷脂的23%，而PI含量最少，在36 h时首次检测到LPC的存在，在72 h时其含量增加到0.54%。从图2～5可以看出，海胆性腺磷脂中，PE、PI随着贮存时间延长呈现下降趋势，说明其在贮存过程中发生了降解反应；而PC含量先降后升，推测在存贮前期PC发生降解，而在贮藏后期一些结合态PC水解下来，引起PC提取率上升；在36 h时首次检测到了LPC的存在，推测源于PC发生水解生成。

2.3 海胆性腺磷脂脂肪酸贮藏过程中的变化

黄业传等在研究猪肉加工制品冷藏中脂肪酸组成的变化中发现，在冷藏中甘油三酯的脂肪酸组成基本不变，磷脂中多不饱和脂肪酸的比例显著减少，而饱和单不饱和脂肪酸的比例显著增加[20]。从表4可以看出，海胆性腺磷脂中含有20余种脂肪酸，且多由多不饱和脂肪酸组成，主要

由C20∶4n6、C16∶0、C20∶5n3、C20∶2组成，其中C20∶5n3(EPA)所占比例高达24.99%，在贮存72 h过程中，其含量逐渐降低至23.90%；而C20∶4n6在贮存过程中其含量从18.21%降低至16.20%；在低温贮藏过程中多不饱和脂肪酸含量从60.72%降低至55.70%，磷脂不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸从5.33%逐渐降低至4.33%。本结果与黄业传等研究结果[20]一致，说明海胆性腺磷脂脂肪酸在贮运过程中发生了氧化降解反应。

表4 海胆性腺中磷脂脂肪酸组成

续表4

3 结论

本研究采用HPLC-ELSD方法对海胆性腺中磷脂种类和含量进行定性、定量分析，得出海胆性腺中脑磷脂(PE)、卵磷脂(PC)、磷脂酰肌醇(PI)三种磷脂含量丰富，未检测到鞘磷脂(SM)的存在，4℃贮藏72 h的过程中，PE、PI含量逐渐降低，PC含量呈现先下降后上升的趋势，而在48 h后海胆性腺磷脂中首次出现了溶血卵磷脂(LPC)，推测是因为PC发生降解反应生成了LPC。通过气相色谱测定发现磷脂中含有20余种脂肪酸，在贮藏过程中不饱和脂肪酸/饱和脂肪酸从5.33%逐渐降低至4.33%，说明磷脂脂肪酸发生了氧化反应。通过本研究证明了海胆性腺中的磷脂在4℃贮藏期间发生了氧化水解反应，初步总结了冷藏过程中海胆性腺中磷脂的变化规律，为海胆性腺贮藏运输过程中品质的变化提供理论依据。