电针夹脊穴对坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠针刺镇痛的后效应研究

余文英，李瑜芝，黄明愉，吴倩雯，黄 华，林 栋，林丽莉

（福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122）

神经病理性疼痛是一个持续的过程，病程反复，严重影响着患者的生活质量。目前神经性病理性疼痛的治疗在临床上主要以药物控制为主，缓解症状的同时也带来诸多的毒副作用。近年来研究表明，针刺是治疗各种疼痛，特别是神经病理性疼痛的有效手段，电针镇痛不仅存在即刻效应，而且拥有着特殊的针刺后效应［1-3］。而现代医学认为“夹脊”穴与神经系统、免疫系统和组织的生理病理均密切相关，大量研究已经证实夹脊穴在治疗慢性疼痛上的效果明确［4-6］。环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一种核转录因子，研究表明神经损伤后导致的CREB磷酸化是神经病理性疼痛形成和维持的重要机制［7］。因此本项目组基于脊髓背角细胞效应的角度，观察脊髓背角细胞CREB蛋白的表达情况，分析针刺后镇痛效应可能的作用机制，并进一步探析产生镇痛效应的最佳时间，为规范性临床操作提供科学的理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量220～280 g，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2012-0002。实验期间大鼠自由进食饮水，室温控制在（25±2）℃，光暗周期12／12 h。

1.2 实验试剂 CREB抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；β-actin抗体（美国 Cell Signaling公司）；HRP鼠抗兔IgG抗体（南京诺维赞生物科技有限公司）。

1.3 实验仪器 超声波细胞粉碎仪（美国SONICS公司）；Infinite M200 PRO全自动酶标仪（瑞士TECAN公司）；ChemiDoc XRS＋化学发光成像分析系统（美国BIO-RAD公司）；华佗牌SDZ-Ⅱ型电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司）；电热恒温槽（上海华进医疗器械有限公司）。

2 实验方法

2.1 大鼠热痛阈的测定 将大鼠置于黑色布袋中，头部在前，尾部在后，露出布袋外，待大鼠安静后开始测量。测试时间为上午8：00-12：00，将大鼠尾部中下1／3部分浸烫50℃的热水中，以其甩尾时间作为痛阈值，用秒表计时。每只以5 min为间隔，共测试3次，取其平均值。所有实验大鼠在入组前均接受热痛阈测定，并剔除热痛阈小于2 s或者大于10 s痛觉异常的大鼠，各组大鼠干预前及干预后均进行热痛阈测定。

2.2 造模与分组 适应性喂养1周后进行热痛阈筛选，并剔除痛觉异常大鼠，采用随机数字表法将SD大鼠分为空白组、模型组、电针后即刻组、电针后0.5 h组、电针后1 h组、电针后2 h组、电针后4 h组、电针后12 h组及电针后24 h组各6只。模型组和电针组参照 Bennett和 Xie［8］的造模方法：大鼠手术造模前1天给予禁食不禁水，用10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔注射以麻醉。麻醉成功后，在大鼠右腿后侧中部施行备皮、消毒、铺无菌巾，剪开术区皮肤约2 cm，钝性分离肌肉，充分暴露右侧坐骨神经中段。用4-0的铬制肠线给予疏松单结结扎4次，每1 mm为一个间隔，松紧度以不影响坐骨神经血液循环和右后肢肌肉出现轻微抖动为标准，结扎线可以在坐骨神经主干上滑动。最后在伤口予青霉素钠盐粉预防感染，缝合皮肤。造模完成后，按照每笼3只进行饲养，麻醉清醒后自由摄食饮水，密切观察生命体征和伤口愈合情况。

2.3 干预方法 电针组大鼠固定于特制鼠笼，使之头尾稍可活动，但身体不可转动，于造模后第7天开始电针治疗。参照《实验针灸学》［9］定位双侧L3～L5夹脊穴，在脊柱旁约0.3 cm处，选用环球牌0.30 mm×25 mm针灸针，直刺进针约2.5 mm。接通电针，参数为：疏密波，2 Hz，1 mA，电针 1 次，留针20 min，强度以大鼠肢体轻微颤动，但不出现挣扎为准。空白组和模型组大鼠不予任何干预措施，仅固定20 min。

2.4 取材 各电针组分别于电针后即刻、0.5、1、2、4、12、24 h进行取材，空白组与模型组固定20 min后即刻取材。以10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔麻醉大鼠，腹腔面朝上固定，打开胸腔，暴露心脏。灌注用针头自左心室插入主动脉，固定针头，剪开右心耳。用200 mL注射器注入0.9%NaCl冲洗血管后，用手术剪刀在大鼠背部正中线剪开皮肤，分离脊柱两侧肌肉，暴露出胸、腰、骶段脊柱，先游离坐骨神经至椎管处，再剪开椎板暴露脊髓，用玻璃分离针挑开脊膜，最后迅速将脊髓剪下，截取脊髓腰膨大（L4～L6节段脊髓），迅速丢入液氮中，待脊髓全部取出，即刻移入－80℃冰箱保存备用。

2.5 观察指标及方法

2.5.1 大鼠热痛阈值测定 检测9组大鼠干预前与干预后热痛阈值。

2.5.2 Western Blot法检测CREB蛋白的表达

裂解蛋白后进行BCA蛋白定量，取30 μg蛋白样品上样，进行SDS-PAGE电泳，进行SDS-PAGE电泳，将表达产物电转移至PVDF膜上。在封闭液中封闭1～2 h后，TBST中清洗 10 min，加入 CREB一抗（1∶5 000）、β-actin 一抗（1∶1 000），4 ℃摇床孵育过夜。次日，TBST清洗3遍，每遍10 min，加入二抗（1∶10 000），室温摇床孵育 1 h。 TBST 清洗 4 遍，每遍5 min，于超高灵敏度化学发光成像系统中显影成像。采用Bio-Rad图像分析软件对条带进行灰度值分析，以目的蛋白与内参蛋白的比值作为目的蛋白的表达值。

2.6 统计学方法 实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料符合正态性分布以（）表示，多组样本比较采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 电针干预前后热痛阈值的改变 见表1。

表1 各组大鼠热痛阈值比较（）s

表1 各组大鼠热痛阈值比较（）s

注：与空白组比较，1） P＜0.01，2） P＜0.05；与模型组比较，3） P＜0.05，4） P＜0.01；与干预前比较，5） P＜0.05，6） P＜0.01。

组别空白组模型组电针后即刻组电针后0.5 h组电针后1 h组电针后2 h组电针后4 h组电针后12 h组电针后24 h组干预后6.00±0.27 4.56±0.321）5.00±0.512）5.50±0.423）5）5.50±0.634）5）5.94±0.624）5）5.89±0.374）6）4.56±0.501）4.28±0.231）n666666666干预前5.78±0.50 4.22±0.311）4.67±0.331）4.22±0.601）4.22±0.371）4.17±0.171）4.17±0.371）4.22±0.311）4.33±0.331）

3.2 9组大鼠脊髓背角CREB蛋白表达比较 见图 1、图 2。

图1 9组大鼠脊髓背角细胞CREB蛋白电泳图

图2 9组大鼠脊髓背角细胞CREB蛋白表达比较

4 讨 论

自Bennett和Xie第一次运用机械痛阈和热痛阈来评价坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）模型以来，CCI模型已经被广泛运用于神经病理性疼痛的造模中。CCI模型的表现与人体周围神经损伤造成的慢性神经痛极为相似［10］，故本课题亦采用CCI模型作为实验的研究模型。电针治病的机理主要是在特定的经络穴位上针刺并施以不同电频持续不断地刺激穴位。大量临床与基础实验研究均证实电针在镇痛方面的显著疗效［11-14］。从传统医学来看，夹脊穴作为人体背部重要的经外奇穴，其不仅入脑，与人体各阳经相汇相通，乃阳脉之海，总督人体一身之阳。现代医学认为，夹脊穴位于人体脊神经的出入口，其解剖位置与神经系统、免疫系统息息相关。因此不管是从传统医学还是现代医学角度，电针夹脊穴均具有镇痛的理论依据。故本研究以CCI模型为基础，以电针夹脊穴为主要手段，观察大鼠在电针干预前后热痛阈值的变化。既往对于针刺镇痛即刻效应的解释多是应用闸门控制学说［15］，然而并不足以解释说明针刺镇痛较长持续时间的后续效应。虽然针刺镇痛的相关研究已经深入分子水平，但仍以电针的即刻效应为主，涉及其镇痛后效应的研究仍在少数，故本课题拟从脊髓背角细胞中CREB蛋白不同时间点（电针后即刻、0.5、1、2、4、12、24 h）表达变化的角度，试图从分子的角度探讨电针镇痛后效应的规律。

CREB蛋白作为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）下游的重要转录因子之一，是一种真核生物细胞核内的调控因子，早期在神经元再生、突触形成及学习记忆等领域的作用被研究者们广泛关注和证实［16］；随着研究的深入，学者们逐渐发现记忆与中枢敏化之间的不可分割性［17］。前期实验研究已经证实中枢敏化是疼痛产生的重要机制之一［18-20］。故近年来CREB在镇痛上的作用也逐渐被研究者们挖掘出来，已有研究表明，神经病理性痛和炎症痛均可上调脊髓背角CREB的表达［21-22］，CREB可能是参与维持疼痛的重要因子之一［23-25］。热痛阈作为疼痛评价的一个相对客观的行为学检测指标，在疼痛模型中已经被广泛认可使用。本研究发现CCI造模后大鼠热痛阈值明显低于空白组（P＜0.01），同时脊髓背角CREB表达量明显提高（P＜0.01）。可见电针镇痛效应的机制可能是下调脊髓背角CREB蛋白的表达。

针灸作用的时效性包括即时效应和针刺后效应，起针后仍存在效应称为针刺后效应。随着针刺镇痛后效应的提出，有学者猜测针灸的时效性与西药半衰期指导患者用药频率、用药剂量等存在相通之处。已有众多学者对针刺镇痛后效应进行研究，张慧等［26］对偏头痛患者进行疼痛强度数字等级量表评分，发现自针刺5 min起镇痛即开始起效，认为镇痛效应可以维持在针刺后8 h。陈瑾等［27］以急性佐剂性关节炎（AA）大鼠作为炎症痛模型，针刺昆仑穴，观察即时及后效应，研究结果发现针刺存在明显的后效应，至少持续30 min以上。赵仓焕等［28］认为电针对AA的镇痛效应可以持续12 h。实验组前期研究也已经发现电针夹脊穴可以发挥镇痛效应，其镇痛效应至少在2 h以上［29］。本研究发现：与模型组比较，电针后0.5 h组、电针后1 h组、电针后2 h组及电针后4 h组热痛阈明显提高（P＜0.01，P＜0.05），电针后即刻组、电针后 0.5 h 组、电针后 2 h组 CREB表达明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。

本研究结果表明，电针夹脊穴具有即时镇痛效应和针刺镇痛的后效应。这可能是通过下调脊髓背角细胞CREB蛋白的表达来发挥镇痛效应，并且其镇痛效应可以维持4 h以上，电针后12 h镇痛效应较差。今后本课题组将进一步开展观察CREB上游或者下游蛋白的表达情况，增加后续效应更多时间点的研究，尤其是针刺后4～12 h时间段，以进一步阐述电针镇痛及其可能的后效应机制。