一测多评法同时测定雷公藤提取物中6种成分含量

吴 珏 ，刘志宏 ，林 兵 ，张敏新 ，林莉莉 ，周桂芝 ，宋洪涛

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.联勤保障部队第九○○医院，福建 福州 350025）

雷 公 藤 （Tripterygium wilfordii Hook.f.） 为 卫 矛科雷公藤属植物，具有祛风除湿、活血化瘀、清热解毒等功效，并具有较强的抗炎和免疫抑制等药理活性。在临床上，雷公藤主要用于治疗类风湿性关节炎、肾病综合征等自身免疫性疾病，疗效显著［1-2］，但其成分复杂，许多有效成分亦是毒性成分，导致不良反应多发且严重程度让患者难以忍受［3-4］，极大程度限制其临床应用。目前，雷公藤未载入《中国药典》，质量控制方法不统一，文献中多以单一成分作为指标报道，如采用HPLC法测定雷公藤甲素、雷公藤红素或雷公藤内酯甲的含量［5-10］。然而仅测定雷公藤中单一成分的含量，并不能全面反应质量，导致各厂家所生产的雷公藤制剂的药效和毒性存在差异［11］。本研究以雷公藤甲素为内参物，建立自制雷公藤提取物中6种有效成分雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲含量同时测定的方法，并对外标法和校正因子法的实测值和计算值进行差异分析，探讨一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）在雷公藤各指标成分含量测定中的适用性。

1 实验材料

1.1 实验试药 雷公藤提取物（自制，批号171227、180326、180708）；雷公藤甲素（含量 99.8%，批号：111567-201404）、雷公藤内酯酮（含量98.3%，批号：111972-201501）、雷公藤红素（含量 97.0%，批号：111946-201501）、雷公藤内酯甲（含量98.1%，批号：111597-200505）均购自中国食品药品检定研究院；雷酚内酯（含量98.9%，批号：CHB170704）购自成都克洛玛生物科技有限公司；雷公藤次碱（含量98.0%，批号：16122331）购自上海同田生物科技有限公司；乙腈、甲酸（色谱纯）购自上海科丰实业有限公司；实验用水均为超纯水。

1.2 实验仪器 Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AL204万分之一天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；十万分之一电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；KQ800KDE型高功率数控超声波清洗器（江苏昆山超声清洗公司）。

2 方法与结果

2.1 定量方法的建立

2.1.1 色谱条件 使用Shiseido-CAPCELL PAK CR 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.05%甲酸水溶液（B），进行梯度洗脱（见表1），检测波长为 218 nm，柱温为 35℃，流速为 1.0 mL／min，进样量为 20 μL。分别取混合对照品溶液、供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，各成分分离度良好，溶剂无干扰。

表1 梯度洗脱时间表

2.1.2 溶液的制备 ①对照品溶液的制备：分别精密称定0.33 mg雷公藤甲素对照品、2.38 mg雷公藤内酯酮对照品、17.80 mg雷酚内酯对照品、21.48 mg雷公藤次碱对照品、1.24 mg雷公藤红素对照品、5.66 mg雷公藤内酯甲，置于25 mL量瓶中，加入少量无水乙醇超声溶解，再用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。②供试品溶液的制备：精密称取100 mg自制雷公藤提取物置于10 mL量瓶中，加入少量无水乙醇超声溶解，再用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.1.3 线性关系考察 分别精密吸取一系列混合对照品溶液各10 μL进样，按“2.1.1”项下的色谱条件进行测定。记录相应的色谱峰峰面积，以峰面积积分值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。结果表明各对照品在一定的质量浓度范围内线性关系良好，见表2。

表2 雷公藤提取物各指标成分的线性方程

2.1.4 精密度考察 取“2.1.2”项下混合对照品溶液连续进样6次，记录各色谱峰峰面积，计算RSD分别为 0.23%、0.31%、0.79%、0.66%、0.09%、0.14%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性考察 取同一批次自制雷公藤提取物按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0、12、24 h注入液相色谱仪，记录各组分色谱峰峰面积。结果显示雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲峰面积RSD值分别为1.51%、1.33%、2.21%、1.24%、1.33%、1.31%，说明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性考察 取同一批次自制雷公藤提取物按照“2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定分析，记录雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的峰面积，计算其质量分数及RSD。结果测得上述各成分峰面积RSD值分别为1.59%、1.80%、1.41%、2.99%、2.91%、1.83%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 称取自制雷公藤提取物6份，每份精密称取100.0 mg，置圆底烧瓶中，分别精密加入含有与样品等量的雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的混合对照品溶液，按照“2.1.2”项下方法制备加样回收率试验供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算溶液中对照品量和各成分加样回收率。结果表明各待测成分的平均加样回收率分别为（101.21±1.33）%、（102.49±1.21）%、（98.74 ±3.28）%、（99.10±2.31）%、（100.40±3.40）%、（101.40±1.80）%，结果表明方法准确性较好。

2.2 相对校正因子的计算 精密吸取“2.1.2”项下的混合对照品溶液分别使用不同进样体积进样并记录峰面积， 按公式 fk／s＝fk／fs＝（Wk／Ak） ／（Ws／As）（式中Wk为内参物质量浓度，Ak为内参物峰面积，Ws为其他对照成分质量浓度，As为其他对照成分峰面积），以雷公藤甲素为内参物（k）计算各进样体积下其他5种成分的相对校正因子fk／s，取其平均值计为该成分对雷公藤甲素的相对校正因子fk／s，结果见表3。

表3 各成分的相对校正因子fk／s值

2.3 雷公藤提取物的含量测定 取 3批自制雷公藤提取物，分别采用外标法和QAMS法测定雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的含量，结果见表4，对两法所测得的各成分含量进行t检验，结果无显著性差异（P＞0.05）。

2.4 相对校正因子耐用性考察

2.4.1 不同仪器和色谱柱的影响及各成分峰定位采用Angilent 1200型高效液相色谱仪、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪和Shiseido-CAPCELL PAK CR 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱对同一批次自制雷公藤提取物进行实验，计算相对校正因子fk／s和相对保留时间tR，结果表明不同品牌仪器和色谱柱对雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的fk／s无显著影响，结果见表5；不同仪器和色谱柱测得的相对保留时间结果见表6。

表4 样品含量测定结果

表5 不同仪器和色谱柱测得的fk／s

表6 不同仪器和色谱柱测得的tR

2.4.2 不同柱温的影响 分别选取30、35、40℃对同一批次自制雷公藤提取物进行实验，计算相对校正因子fk／s和相对保留时间tR，实验结果表明不同柱温对雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的fk／s无显著影响，结果见表7；不同色谱柱温度测得的相对保留时间结果见表8。

表7 不同柱温对fk／s的影响

表8 不同柱温对tR的影响

3 讨 论

本研究建立了QAMS法同时测定自制雷公藤提取物中6种有效成分雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤红素和雷公藤内酯甲的含量，与外标法测定结果无显著性差异，fk／s及tR均具有良好的重复性和稳定性。

选择出峰时间较早的雷公藤甲素为内参物，其药效明确，稳定性好，且文献中所报道雷公藤药材及制剂的质量控制多选择雷公藤甲素为单一指标成分，可据此对其他成分进行校正。

本研究考察不同色谱柱和柱温对6种成分之间fk／s及tR的影响，结果无显著性差异，并且分离度良好，6种成分对温度具有一定的耐受性，色谱峰出峰先后顺序无变化，参照相对保留值并结合光谱图即可准确、快速定位色谱峰。

单一成分的内在质量评价难以控制复杂多样的中药及其制剂，而多指标的质量评价方法对对照品的需求量较大，指纹图谱虽然可以比较全面地反映中药的整体性，但其模糊性的特点使真实准确的质量评价存在一定困难，故本实验建立的一测多评质量评价方法可为雷公藤药材及其制剂的质量控制提供参考。