漫谈硝化作用

陈秋霜 俞如旺

(福建师范大学生命科学学院 福州 350117)

硝化作用是硝化微生物将氨氧化为硝酸的过程，在生物圈氮素循环中占关键地位。硝化作用分为自养硝化作用和异养硝化作用，自养硝化作用又包括经典硝化作用和单步硝化作用。

1 经典硝化作用

1890年，俄国微生物学家维诺格拉斯基首次发现并提出硝化作用，它相比于单步硝化作用提出的时间早一个多世纪，因此称为经典硝化作用，包括两个阶段——氨氧化(亚硝化)和亚硝酸盐氧化(硝化)。

1.1 氨氧化作用 氨氧化作用(亚硝化作用)是指氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria, AOB)在有氧条件下将氨氧化为亚硝酸，并释放化学能的过程。该阶段的化学反应式为：

氨氧化作用包括由中间产物羟氨(NH2OH)联系的两个环节(图1)。底物氨在氨单加氧酶(AMO)的催化下氧化成羟氨，羟氨在羟氨氧化还原酶(HAO)的催化下氧化形成终产物亚硝酸。

图1 氨氧化作用机制[1]

介导氨氧化作用的AOB归属于硝化杆菌科的5个属。其中，亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)归属于β-变形菌亚纲，亚硝化球菌属(Nitrosococcus)归属于γ-变形菌亚纲。

1.2 亚硝酸盐氧化作用 亚硝酸盐氧化作用(硝酸化作用)是指亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite-oxidizing bacteria, NOB)在有氧条件下将亚硝酸氧化为硝酸，并释放化学能的过程。该阶段的化学反应式为：

亚硝酸盐氧化作用需要亚硝酸盐氧化还原酶(NXR)的催化。NXR属于可溶性酶，位于细胞膜靠内的一侧，由三个不同亚基(NxrA、 NxrB、 NxrC)构成，各亚基的Mr依次为： 116×103、 65×103和32×103。 NXR具有多重功能，不仅能催化亚硝酸盐的氧化，还能催化硝酸盐的还原，因为它兼具氧化亚硝酸盐和还原硝酸盐的功能性亚基。意味着NXR能根据氧化还原反应的电势决定工作方向，且差异的外界环境能诱导NXR发挥不同功能，引发菌株进入不同代谢途径，如缺氧条件下将硝酸盐还原。

介导亚硝酸盐氧化作用的NOB归属于硝化杆菌科的4个属。其中，硝化杆菌属(Nitrobacter)和硝化球菌属(Nitrococcus)归属于γ-变形菌亚纲，硝化刺菌属(Nitrsopina)归属于β-变形菌亚纲，硝化螺菌属(Nitrospira)归属于硝化螺菌门。

AOB和NOB总称为硝化细菌。根据AOB和NOB的16S rRNA序列进化关系，两菌群间除硝化球菌属与亚硝化球菌属亲缘关系较近外，其他菌种均属不同纲或不同门，亲缘关系甚远。因此，虽然AOB与NOB在自然界中协同共生，但不存在进化关系上的必然性。

2 单步硝化作用

自1890年来，很多研究均表明硝化作用须严格分步进行。1999年，我国学者郑平等提出不同观点，认为硝化作用底物含能量不高，理论上应更有利于支持单种微生物生长，而非支持两种微生物生长[3]。2006年，Costa等根据理想状态下的动力学理论，认为将氨单步氧化为硝酸盐的过程是可行的，且在热力学层面上更易实现。因为比起经典硝化作用，单步完成的硝化作用代谢过程更短，产能效率更高[4]。Costa等预测了全程硝化微生物的存在，并提出了四种可能获得全程硝化微生物的培养方法。虽然只是设想，但为后续单步硝化作用和全程硝化微生物的发现和培养提供了新思路。

2015年12月，三个科研团队相继发现了3种经过纯化培养的细菌和1种未经纯化培养的细菌具有单独将氨转化为硝态氮的能力[5]。科学家将具有单步硝化作用的细菌命名为COMAMMOX (complete ammonia oxidizers)，意为“全程氨氧化微生物”。Van Kessel等[6]对铵废水进行研究，发现硝化螺菌属的2个种(CandidatusNitrospiranitrosa及C.N.nitrificans)都具有编码AMO和HAO的全套基因以及NXR的亚基。随后，荧光原位杂交放射自显影技术直接表明上述两种微生物具有全程氨氧化能力。Daims等在石油勘探井的热水管壁上获得了一种具有全程氨氧化能力的嗜热细菌，因其近似于硝化螺菌属，故命名“C.N.ino-pinata”[7]。Pinto等在饮用水系统中发现一种类似硝化螺菌属的细菌具备包括AMO和HAO编码基因在内的全套氨氧化基因[8]。

3 异养硝化作用

异养硝化微生物种类繁多，分布广泛。细菌(如产碱杆菌、脱氮副球菌)、真菌、放线菌、甚至藻类等多种异养硝化微生物分布在深海、污泥、土壤和火山口等多种生境中。其中，真菌的数量最大、硝化效率最高。部分异养硝化微生物与硝化细菌有相似的酶系统，两者都具有关键酶AMO和HAO，但两者的AMO和HAO在组成、结构和对底物敏感度等特性上差异较大。例如，研究者从两种异养硝化微生物(Arthrobacterglobiformis、Pseudomonassp.)中获取了部分纯化的HAO，发现其为单体蛋白，而硝化细菌的HAO为三聚体蛋白。异养硝化微生物在数量、生长速率和对环境适应性上远高于硝化细菌。因此，它在某些环境中对硝化作用的贡献相当于硝化细菌，甚至超过。例如，大量数据表明酸性土壤中硝化作用的主导者是异养微生物。

异养硝化作用机理的研究较为困难，已有的研究成果仅限于个别菌株。主要原因包括反应底物广谱性、异养硝化微生物多样性、不同微生物具有的关键酶及其编码基因差异性等。

4 硝化作用对生物圈的影响

氮素循环是生物圈中基本的物质循环之一，循环过程伴随能量转换，维持生物发育和生态平衡。氮素循环过程包含8类反应(图2)： ①生物固氮作用；②硝化作用；③硝酸盐同化作用；④氨化作用；⑤铵盐同化作用；⑥异化性硝酸盐还原作用；⑦反硝化作用；⑧亚硝酸氧化作用。

图2 生物圈中的氮素循环[9]

在全球范围内，硝化作用每年将30亿吨氨转化为硝酸盐(地球上所有植物每年吸收300亿吨二氧化碳)，是氮素循环中不可或缺的环节。硝化作用的终产物是硝酸盐同化作用、异化性硝酸盐还原作用和反硝化作用的原料。硝化作用的不正常运行可能导致氮素循环中断，生态系统瓦解。

氮素是合成植物体内许多重要有机物的原料。硝化作用产生的硝酸盐是植物的主要无机氮肥。因此，土壤中硝化细菌数量和硝化作用强弱是判断土壤肥力的指标之一。然而，虽然土壤中的硝酸盐有利于植物生长发育，但其水溶性强，易随水淋失。随着农业氮肥推广使用，土壤中硝酸盐含量显著升高，大量氮素随水淋失进入地下水，成为潜在污染源，危害人体健康，如引起“高铁血红蛋白病”等。因此，我国规定饮用水中硝酸盐含量的限值为10mg/L。不仅如此，水体中硝酸盐含量过高将引起水体富营养化，导致“赤潮”“水华”等严重污染事件发生。

(基金项目： 教育部人文社会科学研究规划基金项目“核心素养导向的科学课程高中学业水平考试实施策略与命题研究”,No.17YJA880088,*通信作者)