单学时完成PCR与琼脂糖电泳实验的探索

杨柯金

(河南省南阳师范学院生命科学与技术学院 南阳 473061)

1 目前存在的问题

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)与琼脂糖电泳是分子生物学和基因工程实验中的常规实验[1,2]。一次实验课的课时为1～3学时(45min～2h)，常规PCR反应至少需要1.5～2h；琼脂糖电泳中制胶、制样、点样、电泳等过程至少需要1h；实验原理、操作步骤的讲述、学生动手操作、结果点评等过程至少需1h；总体一次PCR与琼脂糖电泳实验需要4h，无法满足教学需要。

2 问题解决途径

通过改良PCR反应体系、缩短仪器运行及电泳时间，从而做到在单学时内顺利完成PCR及电泳实验，以便教师有足够的时间可充分解释实验原理、总结实验结果，帮助学生提高分析、解决问题的能力，满足PCR与电泳实验的教学需求，提高实验教学效果。

2.1 改良PCR反应体系，减少加样种类 常规PCR反应体系包括PCR反应缓冲液、Mg2+、 dNTP、 Taq DNA聚合酶、一对引物、模板DNA、 H2O，反应需加7种试剂。本实验选用2×EasyTaq® PCR SuperMix试剂，该试剂包括了PCR扩增所需的反应缓冲液、Mg2+、 dNTP、 Taq DNA聚合酶4种试剂，用表1反应体系、只需要加4种试剂，缩短了加样过程，更方便学生操作。

2.2 减小扩增目的片段的大小，缩短单次循环反应时间 吊兰是常见的室内观赏植物，实验用吊兰基因组DNA(gDNA)作模板，取材方便。用吊兰gDNA做模板，引物序列(表1)参考于典司博士论文[3]，扩增出来的DNA总长315bp。由于扩增的片断较小，变性、退火、延伸时间均由原来的30～60s降低为10s(表2)，PCR产物经1%琼脂糖电泳后均可发现明亮、单一扩增条带(图1A—1D)，表明该实验参数可用于基因片段的扩增。

表1 PCR反应体系

(注： 引物F： AGGTCTTTTTCCCTGTATCC，引物R： GATTGGCTTTCCATTTACTG)

表2 PCR反应循环参数

2.3 降低循环圈数，缩短总体反应时间 PCR循环圈数也是影响反应时间的一个关键因素，常规的循环圈数为35～40，通过设置20、 25、 30、 35、 40个不同的循环圈数，发现循环圈数为20时，24min即可完成PCR扩增，且经检测发现，PCR产物条带明亮(图1A—1D, 1)，可满足学生实验的需求。

2.4 增大电压、缩短电泳时间 琼脂糖电泳电压要求为3～5V/cm，用150V电压，分别电泳5、 10、 15、 20min(图1)，发现，电泳10min后DNA marker中的100bp、 250bp、 500bp的条带可明显区分开，本实验设计扩增的片段为315bp，界于250～500bp之间，电泳10min足够用来观察条带，判断其位置(图1B)。

2.5 染料加入琼脂糖凝胶中，省略染色过程 常用的染色步骤有两种： 一种是先电泳，后染色；一种是将染料放入琼脂糖凝胶中，边电泳边染色。常用的DNA染料为EB, EB为强诱变剂，具有高致癌性，本实验选用相对较安全的染料GelRed，采用将该染料加入琼脂糖凝胶中的方法进行DNA染色，既相对安全，又节省了时间。

图1 不同循环环数、不同电泳时间PCR产物(注： A～D分别为电泳5min (A)、电泳10min (B)、电泳15min (C)、电泳20min (D)结果；1～5分别为PCR循环圈数20、 25、 30、 35、 40的PCR产物；M为Trans2K® Plus Ⅱ DNA Marker)。

3 教学反思

通过以上改良，选用表1的反应体系、选用表2的反应参数，用GelRed做染料加入琼脂糖凝胶中，150V电泳10min，最终可以在34min完成PCR反应及电泳实验，且实验结果可满足学生实验。

在快速完成该实验的过程中，以下几个问题值得关注： 首先，PCR实验中需要不同量程的微量移液器，该装备价格相对较高，且如果使用不当，极易损耗，如何让每一位学生都能正确、熟练运用微量移液器是一个值得探究的问题；其次，本实验中需要2×EasyTaq® PCR SuperMix和毒性相对小的GelRed为DNA染料，该染料价位相对较高，必使实验经费增加；最后，该实验操作步骤较多，学生是否具有较强的动手能力也是影响本实验在有效时间内顺利完成的一个关键因素，如何在有限的时间内提高学生的动手能力是一个值得关注的问题。

(基金项目： 河南省高等教育教学改革研究与实践项目“网络时代地方高师院校生科师范生教师专业实践能力培养的研究与实践”，No.2017SJGLX425)

*前文受翰思科学仪器公司关注*