保健食品中芬氟拉明的快速检测方法

毓志超

（广州智汇生物科技有限公司，广东 广州 510670）

在市售的各类保健品中，减肥类保健品一直占据着比较大的市场份额。在各类减肥保健品中，含有的非法添加的有害物质，以合成食欲抑制剂最为常见。食欲抑制剂主要包括：芬氟拉明（fenfluramine，FEN）、苯丁胺 （phentermine，PHE）、氯苯丁胺 （chlorphentermine，CPT）、苯甲吗啡 （phenmetrazine，PHM） 和安非泼拉酮（anfepramone，AFP）等。国家食品药品监督管理局发布了关于停止生产、销售和使用盐酸芬氟拉明原料药和制剂的通知（国食药监办 [2009]19号）。

目前，分析检测这类食欲抑制剂的方法以各种色谱技术为主，包括 HPLC（APCI-MS）、LCMS/MS及GC/MS等。但这些方法检测的对象大都是尿样、血样或组织等生物样品及药物片剂，主要应用于法医、毒理、临床及制药等领域，对于基质复杂的保健品分析缺少一定的针对性。本实验对非法添加违禁药物芬氟拉明的快速检测方法，先采用水初步提取，加入盐酸溶液构造酸性反应环境；然后加入对硝基苯胺及亚硝酸钠，利用亚硝酸离子在酸性介质中与对硝基苯胺发生重氮化反应；再加入适量的氢氧化钠溶液中和过量的酸，调节适宜的pH环境；再然后在该环境中使重氮对硝基苯胺可与目标物质芬氟拉明偶联，生成红色偶氮化合物；最后用正丁醇进行萃取提取，振摇、静置，可以使得到的上层溶液颜色更易观察。并根据经萃取后的上清溶液颜色即可判断样品中是否非法添加了违禁药物芬氟拉明：若上层溶液显红色，则判为阳性（不合格产品，非法添加了违禁药物芬氟拉明），若为透明或其他现象判为阴性（合格产品）。该方法更环保，更快速、准确，显色明显且灵敏度高，操作简便，适应性范围广[1-3]。

1 实验部分

1.1 实验仪器

旋涡混匀器、离心机、超声波清洗机。

1.2 试剂及溶液配制

盐酸芬氟拉明（美国sigma公司）；盐酸（分析纯）；对硝基苯胺（分析纯）；亚硝酸钾（分析纯）；亚硝酸钠（分析纯）；氢氧化钠（分析纯）；氢氧化钾（分析纯）；碳酸钠（分析纯）；碳酸钾（分析纯）；正丁醇（分析纯）；三氯甲烷（分析纯）；石油醚（分析纯）。

1.3 材料

保健品基质模拟样品（胶囊、片剂、茶、点心、口服液），样品均为市售的减肥保健品。

1.4 检测方法

1）取待测样品，加入水和试剂A，振摇，离心或静置。

2）取离心液或静置后的上层清液，加入试剂B和试剂C，轻摇，继续加入试剂D和试剂E，振摇，静置，观察静置分层后上层溶液的颜色。

A为盐酸溶液、硫酸溶液和冰乙酸中的一种或几种；B为对硝基苯胺水溶液；C为亚硝酸钠溶液和亚硝酸钾溶液中的一种或两种；D为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠和碳酸钾中的一种或几种；E为正丁醇、氯仿和石油醚中的一种或几种。

步骤1） 中，每1.5～3g待测样品中加入2～4mL水和0.8～1.2mL试剂A。

取待测样品，加入水和试剂A后，然后振摇20～40s，再在 2500～6000r/min 的转速下离心 1～2min 或静置 30～60s。

待测样品为硬胶囊内容物、软胶囊内容物、片剂、丸剂或散剂；水为纯净水、去离子水或蒸馏水。

步骤2）中，每2mL离心液或上层清液中加入 0.8～1.2mL 试剂 B、1～1.5mL 试剂 C、0.8～1.2mL试剂D和1.6～2.4mL试剂E。

取离心液或静置后的上层清液，加入试剂B和试剂C，轻摇10～20s；然后继续加入试剂D和试剂E，振摇30～60s，再静置2～5min。A为盐酸溶液，C为亚硝酸钠溶液，D为质量分数2.5%的氢氧化钠，E为正丁醇。

1.5 前处理方法比较

1）上述试剂A采用盐酸溶液，优化为1mol/L的盐酸溶液。需要说明的是，当试剂A采用盐酸溶液时，更容易回收，且回收率最高，达89%；当试剂A采用硫酸溶液时，回收率为30%；当试剂A采用冰乙酸时，回收率为76%；当试剂A采用盐酸溶液和硫酸溶液的混合物时，回收率为35%；当试剂A采用盐酸和冰乙酸的混合物时，回收率为80%；当试剂A采用硫酸溶液和冰乙酸的混合物时，回收率为34%。

2)取离心液或静置后的上层清液，加入试剂B和试剂C，轻摇，继续加入试剂D和试剂E，振摇，静置，观察静置分层后上层溶液的颜色。若上层溶液显红色，则判为阳性（不合格产品，非法添加了违禁药物芬氟拉明），若为透明或其他现象判为阴性（合格产品）。

优选为：每2mL离心液或上层清液中加入0.8～1.2mL 试剂 B、1～1.5mL 试剂 C、0.8～1.2mL试剂D和1.6～2.4mL试剂E。

取离心液或静置后的上层清液，加入试剂B和试剂C，轻摇10～20s；然后继续加入试剂D和试剂 E，振摇 30～60s，再静置 2～5min。

需要说明的是，本方法中试剂B采用质量分数为1%的硝基苯胺水溶液。

由于亚硝酸钠与亚硝酸钾均可提供反应需要的亚硝酸根离子，但亚硝酸钠更容易制备得到，且制备成本较亚硝酸钾更低。本方法的试剂C优选采用质量分数为1.5%～2.5%的亚硝酸钠溶液。

在阴离子相同的情况下，阳离子与水分子的结合能，与电荷量成正比，与半径成反比，而Na+和K+相比，Na+更容易与水分子结合，导致影响称量的准确度，甚至变潮溶解而无法实验。本实验的试剂D优选为质量分数为2.5%的氢氧化钾溶液。

本实验的试剂E优选采用正丁醇，正丁醇稳定，毒性小，同时交易获得，适合大量使用，且提取反应效率较高。

2 结语

本实验先采用水初步提取，加入盐酸构造酸性反应环境，然后加入对硝基苯胺及亚硝酸钠，利用亚硝酸离子在酸性介质中与对硝基苯胺发生重氮化反应；再加入适量的氢氧化钠溶液中和过量的酸，调节适宜的pH环境，当待测样品中非法添加了违禁药物芬氟拉明，则在该环境中重氮对硝基苯胺能够与目标物质芬氟拉明偶联，生成红色偶氮化合物，若待测样品中未添加违禁药物芬氟拉明，则不会发生偶联反应，即不会有红色偶氮化合物产生；最后用正丁醇进行萃取提取，再振摇、静置，可以使得到的上层溶液颜色更易观察。因此，根据上清溶液颜色即可判断样品中是否非法添加了违禁药物芬氟拉明，若上层溶液显红色，则判为阳性（不合格产品，非法添加了违禁药物芬氟拉明），若上层溶液为透明或其他现象判为阴性（合格产品，未添加违禁药物芬氟拉明）。