抗人N端脑钠肽前体抗原表位分析及单克隆抗体的研制

侯亚璐，井金苗，魏治静，柳峰松，吴萌

1.河北大学 生命科学学院，河北 保定071002；2.河北省科学院，河北 石家庄050081

心力衰竭（心衰）是由于各种心脏结构和功能异常导致心脏收缩和（或）舒张功能受损的一组复杂综合征。当今我国老龄化严重，各种心脏疾病及心血管疾病不断增加，导致心衰的发病率极高，因而对于心衰的诊断和防治迫在眉睫[1]。由各种原因引起的心衰和心脏功能障碍可导致脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）或人N端脑钠肽前体（N-terminal pro-BNP，NT-proBNP）增加[2-4]。2014 版《中国心力衰竭诊断和治疗指南》指出，BNP 或NT-proBNP 有助于预测心衰和术后动态监测（Ⅰ类，A 级推荐）。目前国际上与心衰相关的蛋白标志物应用最多的主要是BNP和NTproBNP，在危险分层方面体现得尤为突出[5]。相对于BNP，NT-proBNP的半衰期、体外稳定时间更长，灵敏度更高，不受标本采集条件的限制，更有利于心衰的诊断[6-8]。

目前，NT-proBNP的检测主要是免疫学方法，应用最广泛的是NT-proBNP 快速检测试剂盒，但所需抗体多为国外垄断，进口成本高，使得国内NT-proBNP检测产品价格居高。因此，研制特异性良好的抗NT-proBNP 单克隆抗体，对推动国内检测试剂的发展具有重要意义[9]。在此，我们采用2种方法预测NT-proBNP B细胞抗原表位，选出最合适的表位肽段，偶联得到免疫原，制备了特异性针对NT-proBNP 抗原表位的单克隆抗体，为研发NT-proBNP 快速检测试剂盒奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/c 小鼠购自河北省实验动物中心；SP2/0骨髓瘤细胞由河北省科学院生物研究所细胞生化研究室保存；多肽合成由吉尔生化有限公司完成；NT-proBNP 重组蛋白购自广州万孚生物技术股份有限公司。

HAT 培养基、HT 培养基、PEG4000、双抗、吐温20、弗氏完全佐剂（FCA）、弗氏不完全佐剂（FIA）、鼠源单抗亚型鉴定试剂盒为Sigma 公司产品；胎牛血清、DMEM 为GIBCO 公司产品；HEPES为Amresco 公司产品；HRP 标记羊抗小鼠IgG 购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

超净工作台（苏州净化设备有限公司）；CO2培养箱（SANYO 公司）；倒置显微镜（Olympus 公司）；酶标板、酶标仪、洗板机、-80℃冰箱（Thermo公司）；恒温水浴箱（上海一恒科技有限公司）；细胞培养板、细胞培养瓶（Eppendorf 公司）。

1.2 NT-proBNP 抗原表位预测及免疫原获得

调取NCBI 蛋白数据库人NT-proBNP的氨基酸序列信息，通过Bepipred[10]线性表位预测方法预测人NT-proBNP B细胞抗原表位；同时，利用Epi⁃tope Prediction System 软件（由河北省科学院生物研究所细胞生化研究室提供），以11个氨基酸残基为一组，对其序列进行包括主链活动性、亲水性、电荷分布、可及性等多参数预测，选择综合抗原表位曲线窗口预测NT-proBNP 抗原表位[11]。综合2种方法比较分析选出最优表位肽结果，合成多肽，并偶联载体蛋白KLH 作为免疫原；NTproBNP 重组蛋白用于抗体鉴定。

1.3 小鼠免疫方案

选6～8周龄雌性BALB/c 小鼠为试验动物，以上述得到的抗原为免疫原，按每只小鼠50 μg 免疫原的剂量免疫4～5 次，每次间隔2周，将免疫原用生理盐水溶解并加入等量弗氏佐剂混合、乳化，在小鼠背部皮下多点注射。第1 次免疫采用弗氏完全佐剂，之后的免疫采用弗氏不完全佐剂。第4 次免疫7 d后，小鼠眼球采血进行效价检测，选取效价达到融合要求的小鼠于融合前3 d 尾静脉加强免疫，抗原加强剂量为30 μg，不加佐剂[12-13]。

1.4 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选

融合前1～2周复苏SP2/0细胞，通过PEG 法将处于对数生长期的SP2/0细胞和加强免疫过的小鼠脾细胞进行融合，将融合后的细胞用HAT 培养基于5% CO2、37℃培养箱中培养，7 d后换液，10 d 左右采用间接ELISA 法检测细胞培养上清，免疫小鼠血清为阳性对照，正常小鼠血清为阴性对照，稀释液为空白对照。将阳性克隆孔通过有限稀释法持续亚克隆，直至筛选出能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

1.5 腹水制备及单抗纯化

将筛选的能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株扩大培养，采用小鼠体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。提前1周向BALB/c 小鼠腹腔接种500 μL 液体石蜡油，之后将处于对数生长期的杂交瘤细胞株注射到小鼠腹腔内，待小鼠腹部肿大突出时采集腹水，离心后收集上清。用Protern G亲和层析柱纯化抗体。

1.6 单克隆抗体的鉴定

1.6.1 抗体纯度鉴定 取10 μg 抗体与4×SDS 凝胶上样缓冲液混匀，沸水煮10 min，上样进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后鉴定抗体的条带。

1.6.2 抗体特异性鉴定 采用Western 印迹鉴定抗NT-proBNP表位肽单克隆抗体与NT-proBNP 抗原结合的特异性。将NT-proBNP 重组蛋白进行SDS-PAGE后，转移到硝酸纤维素膜上，加入制备的单抗作为一抗，HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 作为二抗，加入显色液，观察结果。

1.6.3 纯化后抗体效价测定 采用间接ELISA 法检测纯化后的抗体效价。将NT-proBNP 重组蛋白包被酶标板条，4℃过夜或37℃孵育1 h；用含10%胎牛血清的封闭液封闭；将纯化的抗NTproBNP 单克隆抗体和正常小鼠血清（作为阴性对照）进行梯度稀释，并设置空白对照，37℃孵育；加入HRP 标记的山羊抗小鼠IgG；TMB 显色液显色；硫酸终止液终止反应，酶标仪读取D450nm值。除去空白对照后，待测孔与阴性对照的D450nm比值P/N≥2.1，则为阳性孔，最高稀释率即为效价。

1.6.4 抗体亚型鉴定 采用Sigma 公司的鼠源单克隆抗体亚型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型。

1.6.5 抗体亲和力常数测定 参考万文徽[14]、Be⁃atty[15]等的方法，采用非竞争ELISA 法测定抗体亲和力常数。将NT-proBNP 重组蛋白分别以1、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/mL的浓度包被酶标板，筛选的单克隆抗体做系列稀释，用间接ELISA 法测定。读取的D450nm值对抗体浓度的对数值做图，找出不同抗原浓度下的曲线上1/2 最大D450nm值对应的抗体浓度，代入下式计算亲和力常数Ka：

Ka=（n-1）/2（n[Ab']t-[Ab]t），n=[Ab]t/[Ab']t

式中，[Ab']t和[Ab]t分别为2个不同抗原包被浓度对应的抗体浓度（mol/L）。

2 结果

2.1 NT-proBNP B细胞表位预测结果

Bepipred在线预测结果显示，NT-proBNP的抗原表位区域主要在His1～Glu19、Asn22～His23、Val33、Thr36～Ser53、Glu55～Arg62（图1、表1）；用Epitope Prediction System 软件多参数预测预测到2个表位区域Ser15～Gln25、Glu39～Gly49（图2、表2）。综合2种方法预测的结果，选取共有的表位区域并适当延长成2 段序列，在N端连上半胱氨酸并命名为NT-proBNP-P1和在C端连上半胱氨酸并命名为NT-proBNP-P2，见表3。根据此序列合成多肽，并与载体蛋白KLH 偶联，得到完全抗原，测定的浓度分别为2.275和4.118 mg/mL。

图1 Bepipred 预测表位结果

表1 Bepipred预测表位序列结果

图2 Epitope Prediction System 预测表位结果

2.2 重组蛋白NT-proBNP的鉴定

对购买的重组蛋白NT-proBNP 进行SDSPAGE（图3），可知抗原条带相对分子质量约为13×103，与理论大小一致，杂带较少，纯度良好，测定购买的重组蛋白NT-proBNP 浓度为1.85 mg/mL，可用于后期的免疫小鼠血清及抗体鉴定。

2.3 免疫小鼠血清效价检测及单克隆抗体制备

间接ELISA 法检测P1-KLH、P2-KLH 免疫的小鼠血清效价分别达12 800、6400。通过P1-KLH 完全抗原免疫获得6株可分泌NT-proBNP 抗体的细胞株2D5、2C8、2E1、4B9、4D3、4H2；通过P2-KLH 完全抗原免疫获得2株阳性杂交瘤细胞株1F9、5B5。对抗体进行鉴定，从P2和P1表位肽获得的抗体中选择特异性最好的1F9和4H2 分别进行特性分析。

表2 Epitope Prediction System预测表位序列结果

表3 合成肽序列

图3 抗原SDS-PAGE 鉴定结果

2.4 单克隆抗体特性鉴定

2.4.1 效价测定 纯化后的抗NT-proBNP 单抗1F9和4H2 效价分别达4×104和4×105（图4）。

2.4.2 亚型鉴定 鉴定结果表明，这2种抗体的亚型均为IgG1（图5）。

2.4.3 纯度鉴定 将获得的单抗进行SDS-PAGE（图6），均在相对分子质量25×103与50×103附近出现明显的条带，即对应IgG的轻链和重链，且纯度良好。

2.4.4 特异性鉴定 Western 印迹显示，1F9和4H2 能与NT-proBNP 重组蛋白在相对分子质量约13×103处出现明显的条带，表明这2种单抗能与NT-proBNP 重组蛋白特异性结合（图7）。

图4 单克隆抗体的效价分析

2.4.5 亲和力测定 通过Oringin9.0 软件绘制相对亲和力曲线，根据亲和力计算公式，可得出1F9和4H2的相对亲和力常数分别为1.14×107和1.6×107L /mol（图8）。

图5 单克隆抗体的亚型鉴定结果

图6 纯化后单克隆抗体的SDS-PAGE

图7 单克隆抗体的Western 印迹

图8 单克隆抗体的相对亲和力曲线

3 讨论

N端脑钠肽前体检测为心衰诊断和治疗提供了重要的依据，大量的临床应用表明其是反应心衰和心脏功能障碍的不错指标[16]。而研制NTproBNP 定量检测试剂盒必不可少需要特异性强且亲和力高的抗体。

本研究通过Bepipred在线表位预测方法和Epitope Prediction System 软件预测NT-proBNP B细胞抗原表位，综合2种预测结果对比优化选取合适的2个表位肽并合成，因多肽免疫原性低，难以引起小鼠的免疫反应，偶联KLH 得到完全抗原诱发小鼠产生免疫应答。以P1-KLH和P2-KLH为免疫原，采用背部皮下多点注射方法免疫BALB/c 小鼠，利用PEG 进行细胞融合，采用间接ELISA 法和有限稀释法亚克隆共筛选出8株能稳定分泌抗NT-proBNP 单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，选择特异性最好的4H2和1F9 分别进行了特性分析，表明二者具备良好的抗体特性，为NT-proBNP 定量检测试剂盒的研制提供了抗体原料，但其临床应用效果还须进一步的实验验证。