A型肉毒毒素重链在大肠杆菌中的厌氧表达

韦娜，付楚溪，汪建华，熊向华，张惟材

军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100071

肉毒毒素（botulinum neurotoxins，BoNTs）是一类由肉毒梭菌产生的神经毒素，为已知毒性最强的细菌毒素，通过阻碍神经-肌肉突触传递引起松弛性麻痹发挥毒性作用。BoNTs 包括A～G 共7种血清型，其中BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F 能够引起人类肉毒中毒[1-2]。BoNTs的合成包括以下步骤：首先，肉毒梭菌合成相对分子质量（Mr）为150 000的单链前体蛋白，随后在细菌自身内源蛋白酶的作用下，毒素前体被切割为Mr为100 000的重链（HC）和50 000的轻链（LC），二者通过一对链间二硫键连接[3]。

已有BoNT/A在大肠杆菌中表达的研究，但其表达方式及载体构建细节均无明确报道[4-6]。我们曾尝试用pET22b（+）载体在大肠杆菌中好氧表达BoNT/A的HC 但未成功。本实验中我们探索了厌氧表达HC的方法，并且与普通好氧表达条件比较，发现厌氧条件表达的HC 活性较强。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）感受态，PCR 产物纯化试剂盒，质粒提取试剂盒，蛋白定量试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；表达载体pTIG-TrxA 及一抗C25（本所孙志伟研究员惠赠）；DNA 序列、寡聚核苷酸引物（北京奥科生物技术公司合成）；限制性内切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶（TaRaKa 公司）；二抗羊抗人IgG（北京欣经科生物技术有限公司）；其他试剂耗材（军事医学研究院条件处）。

1.2 HN编码序列的设计合成

参照GenBank 公布的BoNT/A-HC基因序列，按大肠杆菌偏好密码子对重链N端（HN）编码序列进行密码子优化。

1.3 HC表达载体的构建

以携带合成的HN编码序列的载体及pTIGTrxA-HC为模板、HF-E/R 及F/HR-X 为引物（表1），分别PCR 扩增HN与重链C端（HC）编码序列（PCR 扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30 次循环；72℃终延伸10 min）。PCR 产物1∶1 混合为模板、HF-E/HR-X 为引物，重叠延伸PCR 连接HN与HC编码序列（PCR 扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸3 min，30 次循环；72℃终延伸10 min）。PCR 产物与载体pTIG-TrxA 经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，回收连接后转化大肠杆菌DH5α。

表1 引物及序列

1.4 HC表达条件的考察

主要考察不同菌落、培养方式（摇床培养、静置培养）、培养基体积（5、10、15 mL LB）、抗氧化剂硫代乙醇酸钠（STGC）浓度（0%、0.05%、0.1%、0.2%）等因素对HC表达的影响，实验采取多因素多水平正交设计。

1.5 ELISA

抗原包被96 孔板，4℃过夜，洗板3 次；加200 μL 含5%脱脂奶粉的PBST，37℃封闭2 h，洗板3 次；加100 μL 一抗C25，37℃孵育2 h，洗板3次；加辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，37℃孵育2 h，洗 板5 次，OPD 显 色。OPD 显 色 条 件：5.14 mL 0.2 mol/L Na2HPO4与4.86 mL 0.1 mol/L柠檬酸混合，加入50 μL 30%的H2O2，混匀，加入4 mg OPD，混匀，每孔100 μL，室温作用5 min，加50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应。

1.6 蛋白表达定量

以不同浓度BoNT/A-HC与C25[7-8]的结合做标准曲线，ELISA检测HC与C25的结合，测定D490nm值，根据标准曲线计算HC表达量。

2 结果

2.1 HN编码序列的设计

根据密码子简并性，按大肠杆菌偏好密码子设计HN编码序列，优化后序列与原序列相似度为79.70%。

2.2 HC表达载体构建

以携带合成的HN编码序列的载体及pTIGTrxA-HC为模板、HF-E/RF/HR-X 为引物PCR 扩增HN与HC编码序列，产物进行琼脂糖凝胶电泳。重叠延伸PCR 连接HN与HC编码序列，获得约2500 bp的片段，切下目的条带用PCR 产物纯化试剂盒回收，与载体pTIG-TrxA 经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，回收载体与HC基因，16℃连接过夜，次日转化大肠杆菌DH5α，挑取克隆，提质粒经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定（图1），将阳性克隆测序，测序结果与设计序列完全一致。

2.3 HC表达条件的考察

2.3.1 HC 好氧表达 将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），涂LB/Amp 平皿，挑取菌落，37℃、200 r/min 摇床培养至D600nm约0.5，30℃、0.5 mmol/L IPTG诱导，样品进行SDS-PAGE，结果显示Mr约100 000 处有特异条带（图2）。切下特异条带进行胶内酶切肽谱鉴定（图3），结果显示所表达的特异带为BoNT/A-HC。

对诱导剂IPTG 浓度（0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.1、0.2、0.5 mmol/L）、诱导时间（6、8、12 h）、诱导温度（20℃、30℃）进行正交设计，考察目的蛋白的表达，SDS-PAGE检测。结果见图4，0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导6 h 时目的蛋白表达量相对较大，但目的蛋白几乎不与C25 抗体结合，

图1 质粒pTIG-TrxA-HC的EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳

图2 SDS-PAGE检测HC的好氧表达与厌氧表达

图3 HC胶内酶切肽谱鉴定

2.3.2 HC 好氧表达与厌氧表达比较 将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），涂LB/Amp平皿，挑取菌落分别摇床培养和静置培养，30℃、0.5 mmol/L IPTG诱导，样品进行SDS-PAGE和与C25的ELISA 检 测。SDS-PAGE 结 果 显 示 厌 氧 培养时HC 条带大小约100KD，摇床培养表达的HC条带Mr略低于100 000（图2）；ELISA 结果显示，厌氧培养时表达的HC与C25的结合活性远远高于摇床培养，摇床培养时表达的HC与C25 结合活性极不稳定，有时能检测到微弱结合，有时几乎检测不到结合（图5）。

取72 支试管，等分为3 组，探讨培养方式、培养基体积、抗氧化剂浓度等因素对HC表达的影响。收集菌体，超声裂解，包被96 孔板，ELISA检测菌体裂解液与C25的结合，测定D490nm值，结果见表2；培养基体积为5～15 mL 时，3个菌落的目的蛋白表达量与培养基体积基本呈S 型曲线关系（图6），而抗氧化剂浓度对HC表达的影响不明显。

2.3.3 HC表达定量 将BoNT/A-HCC梯度稀释，ELISA检测与C25的结合，以lg（BoNT/A-HCC）为横坐标、D490nm为纵坐标做标准曲线（图7），根据标准曲线计算得HC表达水平为64.7 μg/mL。

图4 ELISA检测好氧表达的HC与HCC抗血清及C25的结合

图5 不同单菌落好氧或厌氧表达HC与C25 结合的ELISA检测

3 讨论

我们最初尝试用pTIG-TrxA 好氧表达HC，得到了相对分子质量疑似正确的HC（图2），ELISA结果显示HC 可以与HC 抗血清结合，并且肽谱鉴定比对结果也显示所比对的序列的确属于HC，但动物实验结果表明该HC 活性远远低于阳性对照组，由此我们怀疑所表达的HC 并不完整，可能只是HC的一部分。我们推测是因为表达的HC对宿主菌有毒性，激发宿主菌的保护机制，从而导致表达不完整的对宿主菌无毒性的蛋白或完整的HC 被降解，具体原因有待进一步考察。为了解决这个问题，我们尝试了厌氧表达。SDSPAGE 显示厌氧表达条带的相对分子质量比好氧表达条带稍大，而厌氧表达条带与C25的结合活性远远高于好氧表达，动物实验结果也显示厌氧表达的HC 活性远远高于好氧表达。这一方面说明厌氧条件更加适合HC的表达，另一方面也说明可以通过与C25的结合检测HC 活性，但不能通过与HC 抗血清的结合检测HC 活性，这可能是因为抗血清中有针对HC 多个表位的抗体的缘故。

对HC 厌氧表达条件的考察结果显示，3个因素对HC表达量影响大小依次是培养方式＞培养基体积＞硫代乙醇酸钠浓度。在厌氧表达时，硫代乙醇酸钠的浓度几乎看不出来影响，但在好氧表达时可见（尤其是2 号菌落更加明显）在实验浓度范围内，硫代乙醇酸钠浓度越高，HC表达量越高，这也进一步说明了厌氧条件对HC表达的重要性。

虽然表达的HC 已经达到较高水平，但厌氧培养菌体生长速率很低和菌浓有限成为HC 大量制备的瓶颈，高效表达HC的方法依然有待进一步探索。我们考虑从如下几方面考察HC 厌氧表达与好氧表达效率差别如此之大的机制，以从根本上解决HC 发酵的难题。首先，厌氧条件和好氧条件所导致二者最直观的区别表现在生长速率上，在一定范围内，厌氧条件越严格，菌体生长越缓慢，所以我们需要证实是否菌体生长速率影响了HC的表达。其次，就是上文所述的HC 好氧表达降解的问题，我们希望能够通过蛋白测序或精确分子量质谱获得好氧条件下表达的低活性HC的信息，这样或许能够通过对HC的改造解决难题。另外，更深入地比较厌氧与好氧条件下大肠杆菌及HC 相关机制（如呼吸链[9]、转录组学[10]）也显得很有必要，一方面有望通过这一途径解决HC 发酵的问题，另一方面也可以更进一步研究大肠杆菌的生物学特性，为其他蛋白在大肠杆菌中的表达提供新的思路。

表2 不同试验条件下HC与C25的结合（D490nm）

图6 不同菌落不同STGC 浓度时HC 厌氧表达情况

图7 ELISA 定量有活性的HC表达量标准曲线