人SIRT6蛋白的原核表达及纯化

罗沙柳，任鑫鑫，罗菲，梁迎春，马超，刘坤，冉芳，施亚娇，李玲，叶棋浓

1.贵州大学 医学院，贵州 贵阳550025；2.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100850；3.山西医科大学 第二医院，山西 太原030000；4.大连医科大学 肿瘤干细胞研究院，辽宁 大连，116044；5.中部战区总医院 卫勤部科训科，湖北 武汉430072

Sirtuins（SIRT）家族中的沉默信息调节因子2（silent information regulator 2，Sir2）最早在酵母中被发现[1]。迄今，科学家们在哺乳动物中已经确定 了7种与Sir2 同 源的基因，即SIRT1～SIRT7[2]。人类的SIRT6基因位于染色体19P13.3 区域，包括8个外显子，编码的蛋白全长355个氨基酸残基，相对分子质量39×103，等电点9.12[3]。SIRT6 最初被认为是单-ADP-核糖基转移酶，可以通过分子内机制完成放射性标记的转移，这表明SIRT6 可能利用ADP-核糖基化来自动调节自身活性，但是其最主要作用还是作为组蛋白脱乙酰酶[4-9]。

目前研究证明，SIRT6在基因组稳定性、代谢、染色质调控、端粒完整性、基因转录和糖脂代谢等方面都起关键调控作用，调节糖尿病、心脏病、肥胖、癌症及寿命、衰老等相关病理生理的发生发展[10-12]。SIRT6在体内控制许多代谢途径，包括糖酵解、糖异生、甘油三酯合成和LDL-胆固醇稳态，SIRT6 缺乏导致主要代谢缺陷[13-16]。对于癌症，SIRT6 可以通过多种机制发挥抑癌作用，敲除SIRT6的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）比野生型MEF细胞生长增殖快，且敲除SIRT6 有促进肿瘤发生的作用[13]；敲除SIRT6基因的肿瘤细胞的乳酸生成、葡萄糖摄取等均增加[17]。对116例乳腺癌病人的组化分析显示SIRT6 高表达的病人生存预后差，SIRT6 通过调控FOXO的表达降低肿瘤细胞对化疗药的敏感性；在前列腺肿瘤组织和前列腺癌细胞中SIRT6表达都高于正常或癌旁组织，且敲低SIRT6 降低细胞活力，增加药物的敏感性等；这又从另外一个层面说明SIRT6 发挥致癌作用[17-20]。有文献报道SIRT6 能与缺氧诱导因子HIF1α相互作用[17]，从而调控肿瘤的代谢重编程。

在本研究中，我们构建了带GST 标签的人SIRT6基因原核表达载体，表达纯化获得重组GST-SIRT6 蛋白，验证了SIRT6与HIF1α之间的关系，有助于进一步探讨SIRT6在肿瘤发生发展中的调控机制。

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）感受态细胞购自北京博迈德科技发展有限公司；人乳腺文库、带GST 标签的pGEX-KG 原核表达载体为本室保存；PCR 试剂、限制性内切酶及DNA 连接酶购自TaKaRa 公司；质粒提取、胶回收试剂盒购自Pro⁃mega 公司；GST-Sepharose 4B 珠购自Pharmacia 公司；HRP 标记的抗GST 单克隆抗体购自GE Healthcare Life Sciences 公司；引物合成及测序由北京博迈德科技发展有限公司完成。

1.2 人SIRT6基因编码区的获取

根据GenBank 中的人源SIRT6基因编码序列设计上游引物5'-CGGGATCCATGTCGGTGAATT ACGCGGCGGGG-3'和下游引物，5'-CCGCTCGAG TCAGCTGGGGACCGCCTTGGCCT-3'。以本室保存的乳腺文库为模板，用Primer Star DNA 聚合酶扩增目的基因片段（PCR 程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸75 s，共35个循环，72℃再延伸5 min）。琼脂糖胶检测PCR 产物，切出目的基因片段，用胶回收试剂盒回收目的片段。

1.3 GST-SIRT6 重组质粒的构建及鉴定

将回收的目的基因片段及载体GST 分别用限制性内切酶BamHⅠ/XhoⅠ于37℃双酶切4～6 h 或过夜，琼脂糖凝胶电泳回收双酶切后的PCR 产物及载体。将双酶切的PCR 产物及载体用T4DNA连接酶于16℃连接6 h 以上后转化大肠杆菌DH5α感受态，挑菌进行菌液PCR 鉴定，将鉴定得到的阳性克隆用质粒提取试剂盒提取质粒，双酶切鉴定，并送北京博迈德生物公司测序。

1.4 重组质粒GST-SIRT6的诱导及表达鉴定

将测序正确的GST-SIRT6 重组质粒转化大肠杆菌BL21 感受态并涂于含氨苄青霉素的LB 板上，37℃恒温箱中培养过夜，挑取单菌落于装有5 mL 含氨苄青霉素的LB 培养基的10 mL 试管中，于37℃、200 r/min 摇床上振荡培养过夜，按1∶50 将菌液稀释，30℃培养至D600nm约为0.6，用终浓度1 mmol/L的IPTG 小量诱导，调定温度至20℃继续振荡培养4～6 h。收集诱导前、后的菌液，裂解后行Western 印迹，鉴定有无SIRT6 蛋白表达。

1.5 GST-SIRT6 融合蛋白的纯化

挑选出能诱导GST-SIRT6 蛋白的重组大肠杆菌BL21 接种于5 mL 含氨苄青霉素的LB 中，37℃培养过夜，将菌液转移到300 mL 含氨苄青霉素的LB 中，30℃、200 r/min 振荡培养4～6 h，直至菌液D600nm为1.0～1.5，再 按1∶10 000的比例 加 入IPTG，20℃、200 r/min 培养16～24 h。离心收集菌体沉淀，加入裂解液重悬，冰浴30 min 使菌体充分裂解，再用超声波裂解细菌，收集上清液，加入GST-Sepharose 4B 纯化珠，4℃旋转结合4 h 或过夜，离心收集结合蛋白后的GST-Sepharose 4B 纯化珠，缓冲液洗脱未结合的蛋白后得到纯化的融合蛋白，行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色鉴定。

1.6 GST-pulldown 实验

用5 μg MYC-HIF1α真核表达载体分别转染2个6 cm 皿的293T细胞系，24～48 h后收细胞，超声波裂解半小时，4℃、12 000 r/min 离心5 min，取25 μL 上清，加入等量2×SDS 上样缓冲液作为结合前的蛋白样，将剩余上清与已纯化的GST、GST-SIRT6 蛋白珠于4℃结合4～6 h，再用IP缓冲液洗涤蛋白珠，弃上清，加入2×SDS 上样缓冲液，Western 印迹检测。

2 结果

2.1 GST-SIRT6 重组质粒的构建与鉴定

以本实验室保存的人乳腺文库为模板，PCR扩增人SIRT6基因的编码序列，获得1059 bp的DNA片段，与预期大小一致（图1）。将BamHⅠ/XhoⅠ酶切后的PCR 产物与GST 载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑菌后进行菌液PCR 鉴定，获得与目的条带1059 bp 大小接近（图2）的克隆，初步认定是带有人源SIRT6基因的阳性重组克隆。选取阳性克隆提质粒，酶切鉴定，可切出长度分别约为5000和1059 bp的条带，而相应的空载体酶切后只见大条带，与预期结果相符（图3）。重组质粒测序结果表明，插入的DNA片段序列与人SIRT6基因的编码序列一致（序列略）。

2.2 GST-SIRT6 重组质粒的表达鉴定

分别用HRP 标记的抗GST 单克隆进行West⁃ern 印迹，结果见图4。泳道4 相对分子质量68×103左右有抗体特异结合条带，即GST-SIRT6 融合蛋白（谷胱甘肽转移酶GST 相对分子质量26×103左右，SIRT6 为42×103左右）。泳道4 相对分子质量26×103～42×103是蛋白降解带。结果与预期一致，说明GST-SIRT6 融合蛋白表达正确。

2.3 融合蛋白GST-SIRT6的纯化

图1 PCR 扩增人SIRT6的编码序列

图2 重组质粒GST-SIRT6的菌液PCR 结果电泳图谱

图3 重组质粒GST-SIRT6的BamHⅠ/XhoⅠ双酶切电泳图谱

利用GST-Sepharose 4B 亲和珠对GST-SIRT6进行纯化，行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，泳道2可见相应蛋白条带出现（图5）。

2.4 GST-pulldown 实验

将MYC-HIF1α转染293T细胞，所提取的蛋白和纯化的GST、GST-SIRT6 蛋白珠结合，进行SDS-PAGE，分别用MYC-HRP和GST-HRP 抗体检测，结果如图6。结合后孵育MYC-HRP 抗体，泳道2 出现特异蛋白条带，证明MYC-HIF1α与GSTSIRT6 融合蛋白有相互作用。

3 讨论

图4 Western 印迹检测融合蛋白的表达

图5 重组蛋白GST-SIRT6的纯化

目前研究发现SIRT6在肿瘤中的作用具有争议。SIRT6 最近被证明是一种明显的肿瘤抑制因子，在人类多种癌症中SIRT6 蛋白水平偏低，如在肝癌、胰腺癌、卵巢癌和结直肠癌等中都下调或突变[18-20]。在卵巢癌中，SIRT6 通过降低Notch3 抑制肿瘤增殖[21]。SIRT6 还通过控制Lin28b 抑制胰腺癌的发生发展。然而，SIRT6在前列腺癌、皮肤癌和乳腺癌等其他一些癌症类型中高表达，并作为癌基因发挥作用，在小细胞肺癌中也有类似的现象[22]。在癌症发生发展中，增加蛋白质合成对癌细胞的存活、增殖、发展和转化至关重要[23-24]。Ravi 等发现SIRT6 可以通过与转录因子SP1 结合，一起转录调控mTOR 信号通路，从而调控蛋白质合成来影响肿瘤的发生发展[25]。另有报道，SIRT6通过ERK1/2/MMP9 通路调控骨肉瘤的迁移和侵袭[26]。SIRT6 通过抑制糖酵解相关基因的表达来调节葡萄糖代谢的稳态。SIRT6 通过在HIF1α靶基因启动子上使H3K9 脱乙酰化而起到HIF1α转录活性的共抑制剂的作用，当SIRT6 失活时，HIF1α被激活，糖酵解基因启动子的乙酰化与多个代谢基因的表达增加，并最终导致糖酵解的增加和线粒体呼吸的减少[17]。SIRT6与SIRT1 直接结合后可以去乙酰化hnRNPA1，从而抑制肝癌细胞糖酵解和增殖[27]。综上所述，SIRT6在肿瘤的发生发展中都起到了关键作用。

SIRT6 通过一些酶反应尤其是去乙酰化，可以模拟染色质在致密状态（如SREBP1和PCSK9）来抑制基因表达[28]。有报道发现SIRT6 可以通过HIF1α来调控Pdk1、Ldha、Pfkl1 等糖酵解相关基因[13]，从而调控肿瘤代谢重编程[17]。在此我们进一步验证了SIRT6与HIF1α在体外有相互作用，为后续研究SIRT6与HIF1α在肿瘤中对肿瘤糖代谢的影响进而影响肿瘤的发生发展奠定了基础。

图6 GST-pulldown 验证GST-SIRT6与MYC-HIF1α的体外相互作用

本研究构建了带GST 标签的SIRT6 原核表达载体，并在IPTG诱导下表达了GST-SIRT6 融合蛋白，Western 印迹鉴定证实了目的蛋白的表达。该重组质粒的构建，为后续研究SIRT6在肿瘤中的发生发展制备了材料。