金黄色葡萄球菌肠毒素B精制免疫球蛋白对小鼠中毒模型的免疫救治效果研究

韩慧，李敏，杨晓岚，段跃强，谷宏婧，范铁炯，李鑫，杨鹏辉，刘媛，闫芳，郑源强，石艳春，赵忠鹏

1.内蒙古自治区分子生物学重点实验室，内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特010058；2.病原微生物生物安全国家重点实验室，军事科学院 军事医学研究院 微生物流行病研究所，北京100071；3.上海赛伦生物技术股份有限公司，上海 201707；4.解放军总医院 第五医学中心，北京100039；5.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷030800

金黄色葡萄球菌是引起人类感染和细菌性食物中毒的一种重要致病菌，在自然界中分布广泛[1]。在欧美各国、日本、东南亚国家及我国，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒时有发生。历年的食物中毒调查表明，由该菌引起的食物中毒事件排在整个细菌性食物中毒的前两位[2]。

金黄色葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal en⁃terotoxin B，SEB）是由金黄色葡萄球菌分泌的一种外毒素，可溶，耐热，不受胰蛋白酶影响[3]。一般情况下，SEB 刺激呕吐中枢会导致以呕吐为主要症状的食物中毒，并且SEB 结合于肠壁上皮细胞的受体，促进肠液与氯离子分泌，引起腹泻症状。另外，SEB 是一种细菌超抗原，非特异性地激活T细胞，并因释放过量细胞因子，产生毒副作用而致病，能引起人呕吐、腹泻、腹痛甚至致死性休克等中毒症状[4]。

目前，我国对SEB 中毒尚无有效防治药品，只能对症治疗。因此，研制SEB 救治药物是一项紧迫的任务。鉴于SEB 至今没有有效的解毒剂，凭借历史上解毒药物开发的经验，利用当代马抗生产技术研制SEB 治疗性抗体，是非常有价值的一种探索[7]。

在本研究中，我们利用成熟的治疗性马抗生物制品制备技术平台，研制出马抗SEB 免疫球蛋白F（ab'）2制品，为SEB 中毒的应急救治提供了候选药。

1 材料和方法

1.1 材料

体质健康蒙古马，4～6岁，10 匹，购自赤峰博恩药业有限公司，经检疫符合现行《中国药典》要求；SPF 级BALB/c 小鼠，6～8周龄，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司；产SEB 重组菌株，实验室自制；产SEB 野生菌株，购自中国食品药品研究院标准品中心。

1.2 重组SEB 免疫原的制备及检定

挑取内含pGEM-7Zf-SEB 质粒的大肠杆菌DH5α单菌落于新鲜培养基中，当菌液D600nm值达0.6～0.8 时，加入1.0 mmol/L的IPTG，于32℃诱导表达10 h，离心得菌体，用0.1 mmol/L的Tris-HCl溶解，超声波破碎，离心去菌体，取上清；将固体硫酸铵加入收集的上清液中，使其饱和度达45%，4℃放置5 h，12 000 r/min 离心10 min，收集上清后继续加入硫酸铵，使其饱和度达75%，4℃放置5 h，12 000 r/min 离心10 min，取沉淀；将沉淀蛋白溶解于1 mol/L 硫酸铵溶液中，调蛋白浓度；将两疏水柱Pheny l FF和Pheny l HP 串联后用1 mol/L的硫酸铵平衡，再将样品以1 mL/min的流速过此串联疏水柱，收集穿透液；穿透液经过夜透析后，以5 mL/min的流速上已平衡的SP阳离子柱，待紫外吸收值回到基线后进行线性梯度洗脱，收集蛋白峰；经SDS-PAGE和HPLC 测定重组SEB 蛋白纯度；在腹腔注射50 μg/kg LPS 激发下，通过腹腔注射重组SEB 蛋白攻击小鼠测定重组SEB 半数致死量（LD50）。

1.3 天然SEB 样品的制备及检定

挑取产B 型肠毒素的金黄色葡萄球菌单菌落于Dolman 培养液中，37℃过夜培养后，以1%的接种量均匀铺于覆盖灭菌玻璃纸的新鲜Dolman 固体培养基平板表面，37℃孵育48 h，用无菌生理盐水收获刮洗菌苔，12 000 r/min 离心15 min，取上清用聚乙二醇8000 浓缩至1/30，置截留量5kD的透析袋中，在4℃条件下充分透析平衡；取平衡透析液至阳离子交换柱CM-32，依次以不同离子强度缓冲液进行阶段洗脱，收集洗脱峰，充分透析平衡；取一定量粗纯平衡液上样至平衡过夜的凝胶过滤柱Sephadex G-75，洗脱，收集第二个洗脱峰，对蒸馏水充分透析脱盐，真空冷冻干燥，即为纯化的天然SEB，4℃保存；用SDS-PAGE和HPLC 测定纯化后天然SEB的纯度，在腹腔注射50 μg/kg LPS 激发下，通过腹腔注射攻击小鼠测定天然SEB的LD50。

1.4 马抗SEB 原料血浆的制备

重组SEB 加入不完全弗氏佐剂乳化制备免疫原，采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检验合格的马匹，间隔21 d，免疫4 次，免疫剂量分别为2、4、8、16 mg。当免疫动物ELISA 效价不低于2000 U/mL 时采集血浆，-70℃保存备用。

1.5 马抗SEB 免疫球蛋白F（ab'）2成品制备及检定

在上海赛伦生物技术有限公司GMP 厂房，按照我们建立的马抗免疫球蛋白F（ab'）2生产工艺进行，制备马抗SEB 免疫球蛋白F（ab'）2成品[8]。按照建立的制品质量规程测定马抗SEB 免疫球蛋白成品F（ab'）2各项指标，合格的产品命名为SEB 精制免疫球蛋白。

1.6 动物法测定SEB 精制免疫球蛋白对天然SEB的中和效果

选用 小鼠45只，5只/组，共9 组。用0.01 mol/L PBS 分别将SEB 精制免疫球蛋白稀释至58.0、67.6、77.2、87.0、96.6、106.2、116.0、125.6 μg/0.2 mL 为实验组，并用0.01 mol/L PBS 将正常马免疫球蛋白稀释至125.6 μg/0.2 mL 为对照组。将实验组、对照组各剂量组加入等体积用0.01 mol/L PBS 配制的5 μg/0.2 mL（10 LD50）天然SEB混匀，37℃放置1 h。将中和后的各组混合液分别腹腔注射小鼠0.4 mL/只，4 h后各组小鼠再腹腔注射用0.01 mol/L PBS 配制的LPS 50 μg/kg（0.2 mL），连续7 d 观察小鼠的存活情况，记录存活率。以小鼠体内中和抗体活性作为SEB 精制免疫球蛋白中和抗体效价换算活性单位，以在小鼠体内中和1 LD50的天然SEB 蛋白所需SEB 精制免疫球蛋白的量为1个用药单位（U）。

1.7 SEB 精制免疫球蛋白制品在动物体内有效性研究

1.7.1 动物法测定天然SEB 合用LPS 对小鼠致病性LD50取 小 鼠35只，分 为7 组，5只/组。用0.01 mol/L PBS 稀 释 天 然SEB 为0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5 μg/0.2 mL 6个剂量组，腹腔注射小鼠作为实验组，以0.2 mL 0.01 mol/L PBS 腹腔注射小鼠为对照组，4 h后各剂量组每只小鼠再腹腔注射LPS 50 μg/kg（0.2 mL），连续观察7 d 并记录小鼠的存活率。根据Reed-Muench 公式计算天然SEB 合用LPS 对小鼠致病性LD50。

1.7.2 小鼠体内治疗试验 选用小鼠25只，分为5 组，5只/组。用0.01 mol/L PBS 将天然SEB 稀释至5 μg/0.2 mL（10 LD50），每只小鼠腹腔注射，随后分别于0、1、2、3 h 每只小鼠静脉注射用0.01 mol/L PBS 稀释至570 μg/0.2 mL的制品，4 h后每只小鼠腹腔注射LPS 50 μg/kg（0.2 mL），以0.2 mL 0.01 mol/L PBS在0 h后肌肉注射小鼠作为对照，观察小鼠的存活情况，并记录存活率。

1.8 安全性检测

按照现行《中国药典》要求，对制品进行无菌试验、热原检查、异常毒性试验、一般药理试验、急性毒性试验、免疫毒性试验、溶血和血管刺激性试验[7-8]。

2 结果

2.1 重组SEB 纯品的制备及检定

对制备的重组SEB 纯品进行检测，结果见图1，经初步优化后，纯化的重组SEB 纯度在90%以上，腹腔注射对小鼠的LD50约为50 μg/kg。

2.2 天然SEB 纯品的制备及检定

对制备的天然SEB 纯品进行检测，结果见图2，经初步优化后，纯化的天然SEB 纯度在90%以上，腹腔注射对小鼠的LD50约为0.5 μg/kg。

2.3 SEB 精制免疫球蛋白的纯度

对制备的成品进行检测，结果见图3，纯化的成品F（ab'）2纯度在80%以上。

2.4 动物法测定SEB 精制免疫球蛋白对天然SEB的中和抗体效价

图1 重组SEB检测结果

研制的SEB 精制免疫球蛋白（表1）在4 μL（116.0 μg）以上时小鼠能够完全存活，而正常马免疫球蛋白对照组小鼠全部死亡，表明研制的SEB 精制免疫球蛋白具有很好的中和SEB 中毒的作用。以在小鼠体内中和1 LD50的天然SEB 蛋白所需SEB 精制免疫球蛋白的量为1 U，则每1 mL（28.5 mg）SEB 精制免疫球蛋白活性为2500 U。

2.5 SEB 精制免疫球蛋白小鼠体内救治效果

图2 天然SEB检测结果

图3 SEB 精制免疫球蛋白成品检定结果

表1 SEB精制免疫球蛋白对10 LD50天然SEB致小鼠模型的中和抗体活性

各时间点注射SEB 精制免疫球蛋白（表2）的小鼠全部存活，小鼠给药后体重虽有下降，但于给药后的第3 d 均恢复至注射天然SEB 毒素前的体重，而没有用SEB 精制免疫球蛋白对照组小鼠则48 h 内全部死亡。由此可见，研制的SEB 精制免疫球蛋白在小鼠体内具有很好的治疗作用。

2.6 SEB 精制免疫球蛋白的安全性

按照现行《中国药典》要求，委托北京昭衍新药研究中心，开展了无菌试验、热原检查、异常毒性试验、急性毒性试验、免疫毒性试验、溶血和血管刺激性试验，结果见表3，均符合现行《中国药典》要求，具有良好的安全性。

3 讨论

金黄色葡萄球菌引起人类化脓性感染、创伤后脓毒败血症、食物中毒等不同综合征，引起动物乳房炎、腹泻、化脓等疾病。在后抗生素时代，临床耐药金黄色葡萄球菌的防治日益严峻[9]。SEB 作为一种外毒素，是金黄色葡萄球菌致病的关键因子之一，是造成呕吐、腹泻、腹痛、休克的核心因素，自身可成为失能性生物武器[10]。因此，金黄色葡萄球菌及SEB 防治研究迫在眉睫。

表2 SEB精制免疫球蛋白在小鼠体内的治疗效果

表3 SEB精制免疫球蛋白成品安全性检定结果

SEB 预防性疫苗在美国已完成Ⅰ期临床试验，安全、有效[11]，在中国还未见报道。目前，我国陆军军医大学团队的金黄色葡萄球菌疫苗已进入临床研究阶段，其中就含有SEB 关键抗原成分[12]。虽然已有报道SEB 中和性单抗、拮抗剂，但均处于实验室研究阶段。鉴于对SEB 中毒至今没有有效的防治手段，凭借毒素抗血清研发历史经验，利用当代马抗生产技术研制SEB 治疗性抗体，是很有前景的一种手段。

马抗血清制品历史悠久，尤其新一代高纯度F（ab'）2抗体仍具有顽强的生命力[13]。本研究研发的SEB 精制免疫球蛋白，从检测结果看，安全、有效、稳定，有望为SEB 中毒提供应急救治措施，目前已进入临床研究阶段。

治疗性马抗研发最核心的环节之一是制备免疫原。我们根据SEB的性质，借鉴现有技术经验，工程性表达、纯化重组SEB，获得了纯度90%以上的纯品，在保存免疫原性的基础上，大幅度降低了SEB 毒性，为免疫动物用抗原提供了物质基础[14]。

抗体研发最关键的环节之一是治疗性抗体的评价。本研究提纯了天然SEB 并建立了SEB 中毒细胞和小、中型动物模型[15]。在3个模型中，我们均证明了制品的有效性，为临床试验奠定了药理学基础，也为药效学评价中细胞替代动物的研究奠定了基础。细胞模型是利用SEB 超抗原的特性，能非特异性刺激细胞增殖，抗体中和后，细胞增殖减少（数据未给出）；小鼠动物模型是利用LPS 激活机体条件下，SEB 致小鼠发生腹泻等严重脱水症状，最终导致死亡；猴子动物模型是利用SEB 致腹泻、中毒等症状，最终导致濒死（数据未给出）。考虑到成本和便于试验数据从实验室过渡到临床，课题组最终以小鼠动物模型为主，进行了SEB 精制免疫球蛋白药效学评价，为临床研究提供了数据支撑。

总之，利用现代生物制药技术，我们制备了SEB 精制免疫球蛋白，有望成为SEB 中毒的候选药，也为SEB 防治产品的升级换代提供了理论和技术支持。