哺乳动物线粒体DNA的转录过程及其机制

李素芬，王唯斯，杨娜，梅雯，孙美涛，熊伟

1.大理大学 基础医学院，云南 大理671000；2.楚雄州人民医院病理科，云南 楚雄675000；3.杭州医学院 基础医学与法医学院，浙江 杭州310000

人类线粒体基因组的转录机制一直是现代医学的前沿问题。人类线粒体DNA（mitochondri⁃al DNA，mtDNA）的转录过程分为起始、延伸和终止3个阶段，需要许多顺式作用元件和反式作用因子的共同参与[1]。目前，已经基本确认了哺乳动物mtDNA 转录装置的重要组成部分，主要包括线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）、线粒体转录因子B2（mitochondrial transcrip⁃tion factor B2，TFB2M）、线粒体RNA 聚合酶（mito⁃chondrial RNA polymerase，mtRNAP）、线粒体转录延伸因子（mitochondrial transcription elongation fac⁃tor，TEFM）及线粒体转录终止因子（mitochondrial transcription termination factors，MTERFs）[2]。在mtDNA 转录过程中，除了必要的转录装置成分调控转录外，一些核转录调节因子也可以通过结合mtDNA 来调控转录。本文总结了mtDNA 转录的基本过程和转录因子在mtDNA 转录起始、延伸和终止过程中的作用，以及调控转录的其他因素。

1 mtDNA的结构

mtDNA 是一个环状的DNA，其长度约为16.5 kb，共编码37个基因（图1A）[3]，其中D-loop 区为非编码区。重链（heavy strand，H）和轻链（light strand，L）是根据2 条链的G+T 含量不同和变性氯化铯密度梯度而划分的，H 链编码2种rRNA、14种tRNA和12种蛋白质（ND6 除外），L 链编码8种tRNA和ND6 蛋白（图1B）[4-5]。人mtDNA的转录由2个启动子指导，即轻链启动子（light strand pro⁃moter，LSP）和重链启动子（heavy strand promoter，HSP），分别位于相对的mtDNA 链中。

2 mtDNA的转录起始

线粒体转录起始过程是由mtRNAP、TFAM和TFB2M 共同参与进行的。其中mtRNAP 是研究最广泛的线粒体转录相关酶，包含1230个氨基酸残基，是线粒体RNA 转录装置的核心。人类细胞中的mtRNAP只有在辅助因子TFAM和TFB2M的参与下，才能与启动子作用启动转录。TFAM 由2个HMG box 结构域和1个C端尾结构组成，有显著的诱导线粒体DNA 形成U 形转弯的能力，对线粒体与其他转录因子的相互作用至关重要。TFB2M是一个促进mtRNAP 启动线粒体RNA 转录的关键因子，其活性远远高于TFB1M[6]。

图1 mtDNA的结构及其转录产物

TFAM 作为转录起始阶段的关键因子，能够被mtRNAP 有效识别，通过与转录起始位点上游的特异性结合激活转录，TFB2M 增强了mtRNAP识别转录起始点的能力[7]。TFAM、TFB2M和mtRNAP 三者之间相互作用，TFAM与轻链转录起始点上游弯曲的DNA 结合，其C端激活区与TFB2M 结合，TFB2M 把TFAM和位于启动子处的mtRNAP 连 接在一起[8]。由 于TFAM和mtRNAP 形成的起始复合物不能在没有TFB2M的情况下转录，TFB2M 作为TFAM和mtRNAP的纽带，可以促进DNA 双链开放，结合启动子，以及诱导mtRNAP的构象变化，稳定启动子复合物，从而提高转录起始效率[1]。

3 mtDNA的转录延伸

转录起始激活后，TEFM 参与转录延伸过程，在体内和体外提高线粒体基因转录延伸的效率和转录活性[2,9]。已有研究表明，保守序列块Ⅱ（conserved sequence blockⅡ，CSBⅡ）是存在于人mtDNA 中的非常重要的转录调节序列，含有富含G的基序序列，在转录终止过程中起关键作用[3]。当mtRNAP 通过CSBⅡ转录时，可以与TEFM 结合形成一种发夹结构G-四链体（G-quadruplex），从而触发转录终止。TEFM 是调控mtDNA 复制和转录转换的关键分子开关。当无TEFM 时，G-四链体的形成使mtRNAP 可在轻链原点附近停止，产生小的RNA片段，作为复制引物，这时mtDNA 开始复制；当有TEFM 时，阻止发夹结构G-四链体的形成，mtRNA 通过CSBⅡ继续转录。

在mtRNAP 介导的转录延伸过程中，mtRNAP和模板DNA 及转录产物RNA 紧密结合，形成一个非常稳定的延伸三维复合物（elongation complex，EC）[10]。研究发现，在没有TEFM的情况下，EC 不稳定，解离与合成非常迅速，但效率低下；TEFM存在时，EC 会继续延长。进一步的研究表明，TEFM 能够决定mtRNAP 产生长的转录本[2]。通过RNA 干扰敲低TEFM后，H 链和L 链启动子远端线粒体转录物的水平降低，并伴随着哺乳动物细胞的氧化呼吸链缺陷[5]。Jiang 等在小鼠中敲除TEFM，证实了TEFM 对线粒体转录延伸和RNA 加工的过程至关重要[11]。

4 mtDNA的转录终止

MTERF 由核基因编码，以单体形式弯曲DNA从而与mtDNA 特异性结合。人MTERF1 是在人线粒体中发现的MTERF 家族第一个转录因子，在线粒体转录中起终止作用。在体外，磷酸化的MTERF1 结合特异的mtDNA 能达到最大的转录终止活性，且不需要其他蛋白因子协助终止[12]。

目前已基本明确，转录终止区域（transcrip⁃tion termination region，TERM）为16S rRNA基因与tRNALeu（UUR）基因分界处一段28bp的序列，MTERF1与该区域特异性结合，引起HSP1 启动的转录终止。已有研究证明，MTERF1在体外还可以高效终止HSP2 启动的转录，以促进rRNAs的合成[13]。MTERF1 控制了从HSP2 到16S rRNA的转录，产生mtDNA 转录环，有助于促进转录因子循环利用和转录反复进行，提高转录速度，使上游rRNA基因的转录水平较下游基因高15～60倍，同时也更容易重新起始转录[13]。MTERF1 特异性识别鸟嘌呤残基进行转录终止，当机体发生线粒体肌病脑病伴乳酸中毒血症及卒中样发作综合征（mitochondrial encephalomyopathy，lactic acidosis，and stroke-like episodes，MELAS）等线粒体疾病时，这种作用会被阻遏[14]。研究发现，MTERF1 中间的结合位点A3243G 突变可以减低MTERF1与DNA的亲和力，从而达到降低转录终止的作用。然而，小鼠体内基因敲除实验表明，MTERF1 能结合双向终止位点，可以完全终止轻链的转录，但重链的转录终止可能还需要MTERF1 以外的蛋白质参与，其具体发生机制目前尚未清楚[6]。

5 mtDNA的转录调控

除了mtDNA 转录机制装置中的核心元件外，细胞核中的某些因子也被导入线粒体与mtDNA结合并直接调控其转录[15-16]。早期研究发现，甲状腺激素可以与D-loop 区和12S rRNA基因结合，并在线粒体定位[17]。此外，研究证实，线粒体cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response ele⁃ment binding protein，CREB）与线粒体D-loop 区的DNA 结合，促进mtDNA基因表达[18-20]。与线粒体D-loop 区结合调控转录的还有细胞信号转导与转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）[21]、组蛋白乙酰转移酶MOF[22]、活化T细胞核因子1（nuclear factor of ac⁃tivated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1）[23]、DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase 1，Dnmt1）[24]，其中Dnmt1 可以降低mtDNA 转录水平。后来研究证明肌细胞增强因子2D（myocyte enhancer fac⁃tor 2D，MEF2D）可以与线粒体ND6 结合并在体内调控转录[25]。最近，多重染色质免疫沉淀实验与深度测序联合，揭示了c-Jun、JunD和CEBP-β在体内与mtDNA 结合及其在体内的线粒体定位[26]，其中c-Jun和CEBP-β与线粒体的ND4 结合，c-Jun 还和JunD与线粒体的ND3 结合。除了通过直接结合mtDNA 调节转录，核转录调节因子可以通过调节线粒体转录因子来调控转录。研究发现，核呼吸因子（nuclear respiratory factor，NRF）NRF1和NRF2 可以控制TFB2M和mtRNAP 从而调控转录[27-28]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因 子1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC1）家族的PGC1α、PGC1β和PRC 依次调节NRF1[29-30]、NRF2[31-32]和转录阻遏蛋白Ying-Yang 1（YY1）[33]，从而影响线粒体基因表达。其中PGC1α可以通过在mtDNA D-loop 区与TFAM 形成复合体来增加线粒体基因在高能量需求期间的表达[34]。此外，线粒体核糖体蛋白L12（mitochondrial ribosomal protein L12，MRPL12）通过控制mtRNAP 稳定性调节线粒体转录过程[35]，其表达与线粒体转录物的稳态水平相关[36-37]。有研究证明，线粒体转录也受线粒体ATP 浓度变化的影响，高浓度的ATP 抑制体外mtRNAP的活性，正常浓度的ATP 激活转录，极低浓度的ATP 阻止转录起始[38]。此外，还有研究发现mtDNA 甲基化可以导致TFAM的翻译后修饰、线粒体类核缩小、限制mtRNAP和TFB2M的作用[39]。已有研究并没有全面描述线粒体转录的调控机制，因此，需要对线粒体转录调控机制进行更加深入地探索。人类mtDNA 调控元件的结合位点参见文献[40]。

6 结语

随着对哺乳动物线粒体功能研究的日益重视，获得了很多线粒体转录因子的结构信息和调控线粒体转录的机制。这些研究使人们对线粒体转录过程及其机制有了更深入的认识，但仍然有很多调节机制和某些调控的细节并不十分清楚，有待进一步探索。目前，新一代测序技术取得了最新进展，为深入研究线粒体DNA 生物学提供了便利，从而加深对转录机制的认识，并有可能为未来的线粒体基因靶向治疗等提供基础研究数据。