敲减HMGB1表达对TNF-α诱导的乳腺癌细胞侵袭能力的影响*

马海明， 强 玲， 刘晓康， 张宝轩△

[1广饶县人民医院肿瘤科， 山东 东营 257300； 2山东省肿瘤防治研究院乳腺淋巴瘤科(内十科)， 山东 济南 250117]

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)具有广泛的抗肿瘤作用，而对于其在肿瘤生物学中的作用仍然存在争议。TNF-α是目前常用的肿瘤生物治疗因子，其参与生物机体内的炎症反应和细胞凋亡等过程[1]。研究报道显示，TNF-α可以诱导乳腺癌细胞的凋亡，促进乳腺癌细胞的侵袭和转移[2-3]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)能够调控细胞的DNA重组、细胞自噬和炎性损伤等，并且与肿瘤细胞的多种生物学特性有关，下调HMGB1表达可以减弱乳腺癌MCF-7细胞的侵袭和迁移能力，并诱导乳腺癌细胞凋亡，下调HMGB1在乳腺癌中发挥抑制作用[4-5]。本研究拟通过体外细胞实验，以乳腺癌细胞MDA-MB-231为对象，用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)敲减乳腺癌细胞中HMGB1的表达，探讨HMGB1对TNF-α诱导的乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响，为明确HMGB1在免疫微环境中对乳腺癌的作用提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 主要材料

HMGB1 siRNA和阴性对照siRNA(siRNA negative control, siRNA-NC)购自Abbexa；荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa；Lipofectamine 2000购自Invitrogen；TNF-α购自Peprotech；胰蛋白酶购自Amresco；兔抗Bax抗体和兔抗HMGB1抗体购自Saierbio；兔抗上皮钙黏素(E-cadherin)抗体购自Novus Biologicals；兔抗基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotease 2，MMP-2)抗体、兔抗神经钙黏素(N-cadherin)抗体、兔抗基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotease 9，MMP-9)抗体和HRP标记的II抗购自Santa Cruz；GAPDH引物和HMGB1引物为南京金斯瑞合成；细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝。

2 方法

2.1细胞分组处理 乳腺癌MDA-MB-231细胞(购自ATCC，用10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，0.25%胰蛋白酶传代)分为对照(control)组、TNF-α组、siRNA-NC+TNF-α组、HMGB1 siRNA+TNF-α组、siRNA-NC组和HMGB1 siRNA组，其中TNF-α组、siRNA-NC+TNF-α组和HMGB1 siRNA+TNF-α组的细胞于实验开始时在培养液中添加15 μg/L的TNF-α；HMGB1 siRNA+TNF-α组和HMGB1 siRNA组为转染HMGB1 siRNA后的MDA-MB-231细胞； siRNA-NC+TNF-α组和siRNA-NC组为转染siRNA-NC后的MDA-MB-231细胞；control组和TNF-α组为不做转染的MDA-MB-231细胞；control组细胞的培养液中不添加TNF-α。MDA-MB-231细胞转染按照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂说明书操作。

2.2实时荧光定量PCR测定HMGB1的mRNA水平 Control组、siRNA-NC组和HMGB1 siRNA组细胞培养24 h以后收集细胞，用细胞总RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA。用分光光度计测定各组样品中的RNA的浓度。以GAPDH为内参照，按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书，首先合成cDNA的第一链，然后以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR程序为：95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s、 60 ℃ 60 s, 40个循环。用2-ΔΔCt法计算各组样品中的HMGB1水平。HMGB1的上游引物序列为5’-GCGAAGAAACTGGGAGAGATGTG-3’，下游引物序列为5’-GCATCAGGTTTCCTTTAGCTCG-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-TCATTGACCTCAACTACATGGTTT-3’，下游引物序列为5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

2.3Western blot测定HMGB1蛋白水平 Control组、siRNA-NC组和HMGB1 siRNA组细胞培养24 h后，加入含PMSF的蛋白裂解液，在冰上放置5 min，使蛋白充分裂解;用细胞刮刀收集细胞，转移到离心管中，放在4 ℃的低温离心机中，14 000 ×g离心20 min。用BCA法对各组蛋白样品进行定量检测。用10%的分离胶进行蛋白电泳，电泳前按照每个泳道中添加40 μg的样品将各组蛋白样品煮沸变性，在浓缩胶中以80 V的电压电泳，当蛋白进入到分离胶以后，用120 V的电压继续电泳至结束。100 V的条件下，在冰上将凝胶上的蛋白电转移到PVDF膜上，封闭，与1∶800稀释后的 I 抗反应以后，与1∶3 000稀释的 II抗结合，以ECL发光，用Quantity One对各自蛋白条带定量分析(GAPDH为内参照)。

2.4流式细胞术测定细胞凋亡 Control组、TNF-α组、siRNA-NC+TNF-α组和HMGB1 siRNA+TNF-α组细胞按照上述方法处理培养24 h后，PBS洗细胞2次，用胰蛋白酶消化各组细胞后，收集细胞沉淀，加入结合缓冲液重悬细胞，再依次添加Annexin V-FITC和PI后，把各组细胞放在避光条件下结合15 min以后，在1 h内上机检测。

2.5Transwell小室法测定细胞的侵袭能力 Control组、TNF-α组、siRNA-NC+TNF-α组和HMGB1 siRNA+TNF-α组细胞按照上述方法处理，用不含血清的培养液把细胞浓度都调整为1×108/L，分别吸取500 μL的各组细胞悬浮液加入基质胶湿化以后的Transwell小室的上室，并且在其下室中添加600 μL含有血清的培养液，培养24 h后，乙醇固定、HE染色以后，在400倍的显微镜下随机选5个视野对侵袭细胞进行计数。

2.6细胞划痕实验测定迁移能力 Control组、TNF-α组、siRNA-NC+TNF-α组和HMGB1 siRNA+TNF-α组细胞融合度超过90%以后，按照2.5方法处理，在长满的细胞底上画一条细痕，并用PBS洗涤2次。添加新鲜的细胞培养液，24 h后，用Image-Pro Plus测定划痕的距离，结果取平均值。以迁移的距离占划痕初始宽度的百分比表示迁移率。

2.7Western blot测定E-cadherin、MMP-2、N-cadhe-rin、MMP-9和Bax的蛋白水平 Control组、TNF-α组、siRNA-NC+TNF-α组和HMGB1 siRNA+TNF-α组细胞按照上述方法处理培养24 h后，用Western blot方法测定E-cadherin、MMP-2、N-cadherin、MMP-9和Bax蛋白水平,方法同2.3。

3 统计学分析

实验数据均采用SPSS 21.0分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间差异的比较用单因素方差分析，多重比较均采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 转染后细胞中HMGB1的表达

转染HMGB1 siRNA后，MDA-MB-231细胞中HMGB1的mRNA和蛋白水平均明显下降(P<0.05)，而转染siRNA-NC对乳腺癌细胞中HMGB1的mRNA和蛋白水平没有影响，见图1。

Figure 1.The expression of HMGB1 at mRNA (A) and protein (B) levels in transfected breast cancer cells determined by RT-qPCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC group.

图1RT-qPCR和Westernblot测定转染后的乳腺癌细胞中HMGB1的表达水平

2 敲低HMGB1表达增加TNF-α对乳腺癌细胞凋亡的诱导作用

MDA-MB-231细胞经过TNF-α作用以后，与对照组相比凋亡率明显升高(P<0.05)，说明TNF-α可以诱导乳腺癌细胞凋亡；转染HMGB1 siRNA后经TNF-α处理，细胞凋亡率更高(P<0.05)，敲减HMGB1表达和TNF-α刺激可以共同诱导乳腺癌细胞凋亡，见图2。

3 敲减HMGB1表达减弱TNF-α对乳腺癌细胞侵袭的诱导作用

MDA-MB-231细胞经TNF-α处理后侵袭细胞的数目较对照组明显增多(P<0.05)，说明TNF-α诱导乳腺癌细胞侵袭；转染HMGB1 siRNA后经TNF-α诱导的侵袭细胞数目减少(P<0.05)，说明HMGB1 siRNA可以减弱TNF-α诱导的乳腺癌细胞的侵袭能力,见图3。

Figure 2.The apoptosis rate in each group analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

图2流式细胞术测定各组细胞的凋亡水平

Figure 3.Transwell chamber determination of the invasion ability of breast cancer cells in each group (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

图3Transwell小室测定各组乳腺癌细胞的侵袭能力

4 敲减HMGB1表达减弱TNF-α对乳腺癌细胞迁移的诱导作用

MDA-MB-231细胞经TNF-α处理后的迁移率明显升高(P<0.05)，说明TNF-α诱导乳腺癌细胞迁移；转染HMGB1 siRNA后经TNF-α诱导的细胞迁移率降低(P<0.05)，说明HMGB1 siRNA可以降低TNF-α诱导的乳腺癌细胞的迁移能力，见图4。

5 敲减HMGB1表达减弱TNF-α对乳腺癌细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的诱导作用

经TNF-α处理后MDA-MB-231细胞中的上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达下调，而间充质细胞标志蛋白N-cadherin表达升高(P<0.05)，提示TNF-α诱导乳腺癌细胞EMT;转染HMGB1 siRNA后经TNF-α诱导的细胞中上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达升高，而间充质细胞标志蛋白N-cadherin表达降低(P<0.05)，说明HMGB1 siRNA可以抑制TNF-α诱导的乳腺癌细胞EMT，见图5。

6 敲减HMGB1表达对TNF-α作用的乳腺癌细胞MMP-2、MMP-9和Bax蛋白表达的影响

MDA-MB-231细胞经TNF-α处理后MMP-2、MMP-9和Bax蛋白的表达水平升高(P<0.05);转染HMGB1 siRNA后经TNF-α处理细胞中的MMP-2和MMP-9蛋白表达水平降低，而Bax蛋白表达水平升高(P<0.05)，说明HMGB1 siRNA对TNF-α处理后的乳腺癌细胞的作用与MMP-2、MMP-9和Bax蛋白表达有关，见图6。

Figure 4.The migration ability of breast cancer MDA-MB-231 cells in each group detected by cell scratch test (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

图4细胞划痕实验测定各组乳腺癌细胞的迁移能力

Figure 5.The expression of EMT marker proteins E-cadherin and N-cadherin in breast cancer MDA-MB-231 cells of each group determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

图5Westernblot测定各组乳腺癌细胞中EMT标志蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达

Figure 6.The protein expression of MMP-2, MMP-9 and Bax in the breast cancer MDA-MB-231 cells of each group determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vssiRNA-NC+TNF-α group.

图6Westernblot测定各组乳腺癌细胞中MMP-2、MMP-9和Bax的蛋白水平

讨 论

TNF-α是一种主要由免疫细胞分泌的抗肿瘤因子，其属于跨膜蛋白，在肠炎、关节炎和牛皮癣等自身免疫疾病中具有关键作用[6-7]。肿瘤小鼠模型经过脂多糖或微生物等处理后，TNF-α是主要的免疫反应因子，其可以引起炎症[8-9]。肿瘤的发生过程中，混乱的基因表达和转录引起肿瘤细胞对TNF-α的敏感度增加，导致肿瘤细胞凋亡增多[10-12]。在多种体外实验中发现，外源性的TNF-α可以促进肿瘤的转移，而在体内实验中发现自身接种TNF-α可以减少黑色素瘤小鼠模型的肿瘤转移[13]。李晓敏等[14]的研究报道显示，给予乳腺癌细胞外源性的TNF-α刺激以后，Transwell小室实验中的乳腺癌细胞穿膜数目增加。侯娟[15]在探讨TNF-α对乳腺癌化疗敏感性的研究中发现，TNF-α可以诱导乳腺癌细胞的凋亡，增加其化疗敏感性。本实验结果表明，TNF-α可以诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡，促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移，这与上述实验报道相符。

HMGB1含有一个可以调控转录的C端和2个可以与DNA结合的结构域，其能够与Toll样受体结合，调控多种炎症因子的释放[16]。在细胞受到外界环境的作用后，HMGB1可以促进TNF-α和内毒素等的释放，介导炎性损伤[17]。在肝癌和乳腺癌等多种肿瘤中已经发现HMGB1过度表达，并且可以调控肿瘤细胞的凋亡、侵袭和迁移过程，影响肿瘤细胞释放免疫因子[18-20]。Ni 等[4]通过细胞转染化学合成的HMGB1 siRNA构建下调HMGB1的乳腺癌MCF-7细胞，通过检测HMGB1表达及细胞增殖、凋亡和迁移水平，结果发现，HMGB1沉默抑制人乳腺癌细胞的侵袭和迁移，促进细胞凋亡，提示HMGB1沉默可能是一种潜在的治疗靶点。本实验表明，HMGB1敲低后的乳腺癌细胞经过TNF-α诱导以后，细胞的凋亡水平进一步增加，而细胞的侵袭和迁移能力下降，这说明HMGB1敲低可以与TNF-α共同发挥抗肿瘤的作用，综合上述实验报道，下调HMGB1不仅具有抗乳腺癌作用，还能够与TNF-α协同共同抑制乳腺癌发生。

肿瘤细胞的侵袭、迁移和凋亡等多种生物学特性都受到细胞内多种蛋白的严格调控。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，其在肿瘤组织中表达下调，而促进其表达后可以诱导肿瘤细胞的凋亡[21-24]。在肿瘤的转移中，肿瘤细胞能够降解细胞外基质的蛋白酶，为肿瘤细胞突破组织屏障提供条件，MMP-2和MMP-9是目前研究发现的能够降解细胞外基质的主要蛋白酶，在多种肿瘤组织中表达升高[25-27]。在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞的上皮细胞特性逐渐消失，而间充质细胞特性逐渐增加，这成为肿瘤细胞的EMT，E-cadherin是上皮细胞的标志性蛋白，而N-cadherin是间充质细胞的标志蛋白，E-cadherin在肿瘤组织中表达下调，而N-cadherin在肿瘤组织中表达升高[28-30]。本实验结果显示，TNF-α处理后的乳腺癌细胞中E-cadherin表达水平下降，N-cadherin表达水平升高，TNF-α诱导乳腺癌细胞EMT，并且细胞中的Bax表达升高，MMP-2和MMP-9水平也升高，而下调HMGB1可以抑制TNF-α诱导乳腺癌细胞EMT，降低细胞中MMP-2和MMP-9水平，促进Bax的表达，这提示下调HMGB1可以通过调控细胞EMT及Bax、MMP-2和MMP-9蛋白表达影响TNF-α对乳腺癌细胞的凋亡、侵袭和迁移的影响。