放射诱导旁观者效应的研究进展

龚玉华，徐中叶

江苏省无锡市人民医院 （江苏无锡 214023）

自伦琴发现X射线至今，电离辐射已经广泛运用于临床疾病的诊断和治疗，其中的放射治疗发展尤为迅猛。人们曾经认为电离射线穿过细胞核引起的直接或间接的DNA损伤是产生放射治疗生物学效应的唯一原因[1]。1992年，Nagasawa和Little发现在单层培养的细胞中，少于1%的细胞的细胞核被单束α射线穿透，出现姐妹染色体交换频率增加的细胞却超过30%[2]。这一发现激发了研究者们对放射诱导的所谓“旁观者效应”的兴趣，一系列与之相关的研究随之开展。利用高线性能量传递（LET）射线如α射线、重粒子，或者低LET射线如X射线、γ射线，针对不同细胞分别进行的体外或体内实验证实了旁观者效应的存在[3-4]，并初步探讨了其发生机制。然而，该效应的确切机制目前尚不清楚。本研究对近十年内提出的放射诱导的旁观者效应（radio induced bystander effects,RIBE）发生机制及其常用研究方法进行综述。

1 研究方法

放射诱导的旁观者效应中存在两类细胞，即“作用细胞”（受照射的细胞）与“反应细胞”（旁观者细胞），前者受照射后产生信号分子通过细胞间连接结构传递或释放到细胞外围环境中，后者接收这些信号并产生与前者相类似的辐射损伤诱导的应激反应，如诱导基因表达、基因突变、微核形成、诱导分化、凋亡、恶性转化等[5]。在诸如X射线、γ射线、重粒子等辐射中，目前使用高LET的α射线，特别是以精确的微束形式甚至特定的粒子数目照射一定的区域、单个细胞或者亚细胞结构[6-7]的方法最为常见。有研究者将“作用细胞”与“反应细胞”共同单层培养或三围聚集培养，旨在保证两者间的物理接触以便于让细胞间的缝隙连接发挥传递信息的作用（gap junctiongmediated intercellular communication，GJIC）。相反，有研究侧重于探讨由“作用细胞”释放入培养基环境中的信号，常在同一培养基中以稀疏集落培养上述两类细胞，或者收集受照射的“作用细胞”周围介质来培养“反应细胞”，即所谓的共培养转移实验（cocuhure/media transfer experiments）[8]。

2 DNA损伤现象

旁观者细胞的DNA损伤在旁观者效应的发生中有着重要的作用，与受照射细胞一样，其DNA可能发生的损伤在类型和分布上都相当复杂，目前已被识别的有20多种，包括碱基突变、DNA单链断裂（SSB）、双链断裂（DSB）以及共价结合所导致的DNA-蛋白质交联、DNA-DNA交联等。在受到直接照射的“作用细胞”中，因DNA双链断裂引起的染色体异常占主导，而“反应细胞”的染色体异常则多因碱基损伤或是单链断裂所致[9]。研究者们常通过观察微核形成（MN）、姐妹染色体交换（SCE）及使用γH2AX foci技术等作为DNA、染色体损伤的证据[10]。Kashino等[11-12]利用共培养转移实验，将接受过1 Gy常规X射线照射的3种中国仓鼠卵巢细胞（CHO）（包括野生型、缺乏SSB修复能力和缺乏DSB修复能力）的培养基质分别转移给缺乏DSB修复能力的xrs5细胞，培养后发现3个样本中xrs5细胞发生MN的程度并无差异。然而，将受X射线照射过的CHO细胞的基质转移到另一培养基中，在这一培养基中同时培养具有DNA修复能力的CHO及不具有DSB修复能力的xrs5细胞，利用克隆形成分析两者，结果发现xrs5细胞对可能存在的“旁观者信号”的敏感程度明显高于CHO。综合以上实验，Kashino等[11-12]提出接收旁观者信号的细胞的DNA修复能力决定了旁观者细胞的复杂应答反应，而非产生这些信号的细胞的DNA修复能力。

旁观者细胞产生DNA损伤影响细胞的功能与存活，是旁观者效应中最关键的环节之一。有研究认为这与旁观者细胞活性氧簇的形成、线粒体功能和线粒体依赖的信号通路以及钙离子的流动[13]有关，其具体机制仍然是一个研究热点。

3 涉及机制

3.1 活性氧簇、线粒体和核因子-кB

活性氧簇（ROS）是一类化学性质极活泼的物质，在正常人体内通过氧代谢产生，对细胞、组织具有一定的损伤作用。研究发现经放射线照射后的细胞ROS增多，另有大量证据表明ROS与旁观者效应的发生密切相关，但是ROS极不稳定的特性决定了其作用时限和范围的局限性，如羟自由基的存在时间和弥散能力均是以纳秒、纳米来计的，这些都提示ROS的作用可能是通过调节信号通路来实现的[14]。Shao等[15]在照射T98G细胞引起AG01522细胞旁观者效应的研究中发现ROS的产生还与NO，TGF-β1有关。Chen等[16]利用共培养转移实验，将rho（+）细胞和 rho（-）细胞照射10 min后的基质分别转移给旁观者细胞培养基，结果发现照射rho（+）细胞得到的基质引起旁观者细胞ROS增加了35%，明显高于另一组，而通过观察γH2AX foci发现ROS增加明显的旁观者细胞DNA损伤较另一组严重的多，另外，ROS清除剂DMSO处理后的细胞DNA损伤明显减轻。该实验一方面证实了活性氧簇在旁观者效应中发挥着巨大作用，另一方面提示了旁观者细胞ROS的量以及DNA损伤程度与受照射细胞的线粒体DNA功能存在一定的联系。研究发现缺乏线粒体DNA的人皮肤纤维母细胞无论作为受照射细胞还是旁观者细胞，其所得到的旁观者效应强度均不如野生型，这一点更加证实了线粒体功能的重要性。利用Bay11抑制核因子-кB活性、PTIO清除NO或通过抑制钙离子的摄取从而抑制iNOS都能增强旁观者细胞的DNA稳定性，减少突变发生的频率[17-18]。

根据以上分析，一条依赖于线粒体功能，有活性氧簇参与，以iNOS、NO、核因子-кB为主线的旁观者效应的调节机制呈现在眼前，这为进一步探究更精确的机制提供了思路。

3.2 可溶性因子扩散与MAPK通路

研究表明，受照射后的细胞可能释放一些可溶性因子，这些因子一方面形成了细胞周围的炎症微环境，另一方面可能与未照射的临近细胞接触，引发旁观者效应，这可能是RIBE发生的重要机制之一。已经被实验证实存在的可溶性因子包括TGF-β1[14]、白介素-6、白介素-8[19]、转化生长因子-α（TGF-α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等。有证据显示白介素-8、TGF-α、TNF-α和TGF-β1可以与旁观者细胞上的相应受体结合，激活旁观者细胞的MAPK信号通路家族[9]。MAPK信号通路家族包括ERK、JNK和p38，以上的分泌因子激活这些通路，并进一步通过核因子-кB、AP1和ATF-2等影响旁观者细胞的生存能力和基因突变，从而表现出旁观者效应。Coates等[20]发现巨噬细胞的应答反应在受照射后炎症微环境的形成和引发基因型依赖的旁观者效应中发挥着重要作用。针对可溶性因子及受体和MAPK通路的深入研究或许将使掌控旁观者效应成为可能。

3.3 GJIC的作用

缝隙连接（GJ）又称融合膜，散在分布于相邻细胞间，是动物细胞中最普遍存在的一种细胞连接。它由6个柱状蛋白质亚基组成，这些亚基环形排列形成通道样结构连接相邻细胞的质膜。这种通道结构可以允许分子量低于1500的水溶性分子直接通过，通道在pH值降低或钙离子浓度升高时会变小甚至关闭，以保护临近细胞不受影响[21]。目前大量证据表明GJIC参与了旁观者效应的发生[2,9]。为研究缝隙连接对于旁观者效应的作用，大部分实验都选用以α射线照射单层培养的细胞中的一小部分，通过观察非照射部分的应答反应进行判断。Shao等[22]尝试使用重粒子（碳粒子束）照射单层培养的人纤维母细胞，发现照射剂量越低，发生微核形成的数目却在增加，并且这种对低剂量照射的敏感性随着GJIC增强剂8-Br-cAMP的使用而增强，相反，GJIC的抑制剂林丹则可明显减弱基因的毒性反应。然而，允许通过缝隙连接的分子种类繁多，可以是核苷酸、多肽或者第二信使等，具体是何种分子的传递引发了旁观者效应有待进一步的研究揭示。

4 总结与展望

经过数十年的研究，人们对旁观者效应的认识正在日渐加深。根据旁观者效应已知的一些特点可以推测，它对肿瘤的放射治疗有着重大的建设性作用：利用它对未照射细胞的影响，可以减少照射剂量，缩小照射范围而达到相同的治疗效果；阻断它对邻近正常组织的效应则可以起到保护正常组织、提升放射治疗靶向特异性的作用。相信随着研究的继续深入，对放射诱导旁观者效应的机制认识将更加透彻，并最终可以将其应用到放射治疗和防护的实际工作中。