表观遗传调控与青光眼发病机制研究进展△

张又嘉 陈宇虹 雷苑

青光眼是全球第一大不可逆致盲眼病，2013年全球40～80岁人群中患病人数为6.43千万，据估计2020年、2040年分别将达7.60千万和1.118亿人[1]。2020年我国青光眼患者也将达2.18千万，届时将超过全世界青光眼患者总数的四分之一[2]。青光眼以视神经进行性损伤为特征，是一种复杂性疾病，多数患者的发病难以用单一基因突变解释，是遗传和环境综合作用的结果。环境因素可以通过表观遗传调控的方式作用于基因组DNA，调节基因的表达，产生长期的表型改变[3]，最终导致疾病的发生；即表观遗传学(epigenetics)在环境和疾病之间架起了一座桥梁[4-5]。本文通过回顾近年来表观遗传学在青光眼研究中的相关进展，揭示表观遗传调控在青光眼发病过程中所起的重要作用，以期为青光眼的病理机制研究提供新的思路。

1 表观遗传学基本概念

表观遗传学的概念由Waddington于1942提出[6]，现指在DNA核苷酸序列不发生改变的情况下，基因的表达产生了可遗传的改变[7]。染色质的基本组成单位为核小体。真核细胞中，核小体由核小体核心和连接区组成。核小体核心由4对核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)和其外面环绕的145～147 bp 的DNA组成；两个核小体之间的连接区包括连接DNA和H1组蛋白[8-9]。核小体进一步折叠，形成染色质的高级结构。根据DNA凝聚程度的不同，染色质可以分为常染色质和异染色质。常染色质结构松散，具有转录活性，而异染色质高度凝聚、转录沉默。两种染色质之间的动态转换调节了基因的表达，进而改变细胞的生物学功能[9]，这种染色质结构的动态平衡变化由表观遗传机制调控[10]。表观遗传学主要机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及小RNA (micro-RNAs，miRNAs)，这些机制共同作用调控基因的特异性表达。近年来研究发现，表观遗传失调在一系列疾病如癌症[10]、心血管疾病[11]、自身免疫性疾病、神经精神疾病[12]等发病过程中起重要作用，也同样参与了青光眼的发病[13-15]。

2 DNA甲基化与青光眼

2.1 DNA甲基化DNA甲基化指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)的甲基被转移至DNA序列上的过程[16]。DNA甲基化是一种稳定的基因沉默机制，可以通过改变DNA结构，排斥转录激活因子，阻遏转录；另外甲基化的DNA还可以通过招募DNA甲基化结合蛋白，阻止基因表达[17]。对于哺乳动物，DNA甲基化主要发生于CpG(胞嘧啶C-磷酸p-鸟嘌呤G)二核苷酸的胞嘧啶残基[10]，生成产物为5-甲基胞嘧啶(5-mC)。CpG二核苷酸并非分布于整个基因组中，而是位于CpG岛和散在重复序列区域中。CpG岛是含有高密度CpG二核苷酸片段的CpG富集区，主要位于基因的启动子区域，人类基因组中约有60%的启动子区含有CpG岛[10]。大多数的CpG岛始终处于未甲基化状态，从而维持转录活性结构，保证基因的正常表达[17]。启动子区域CpG岛的异常高甲基化将会导致基因沉默，从而引起疾病的发生。与启动子中的CpG岛相反，位于散在重复序列中的CpG二核苷酸则呈甲基化的常态，以维持染色体的稳定性[10]。

2.2 DNA甲基化与青光眼关联基因Burdon等[18]进行的一项病例对照研究发现，CDKN2B启动子区域的一个CpG位点的甲基化水平与正常眼压性青光眼(normal tension glaucoma,NTG)明显相关，并且这一相关性主要存在于女性患者中。CDKN2B-AS1已在多个不同种族的全基因组关联性分析(genome-wide association study，GWAS)中被证实与青光眼发病相关[19-22]，CDKN2B作为CDKN2B-AS1的靶基因，在青光眼小鼠模型的视网膜中表达显著增加[19]，其启动子甲基化的异常可能导致了基因表达的改变，进而产生青光眼表型。

2.3 DNA甲基化与眼组织异常纤维化既往研究表明，DNA甲基化水平改变参与调节肾、肝、肺组织的异常纤维化的病理过程[23-26]，说明DNA甲基化在各类组织的纤维化过程中发挥重要作用。同样在青光眼发病过程中，DNA甲基化也参与小梁网和视神经盘的筛板细胞的异常纤维化。小梁网是房水外流的通道，其结构的改变会导致房水外流受阻进而导致眼压升高；筛板区域由孔状的纤维弹性板组成，视网膜神经节细胞轴突穿过筛板区域后汇聚为视神经，二者的异常纤维化是青光眼的重要病理机制[27-29]。

DNA甲基化水平异常导致眼组织异常纤维化主要与转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)信号通路异常相关。TGF-β信号通路异常激活可导致细胞外基质过度堆积，改变细胞骨架结构和细胞间距，使小梁网和筛板纤维化，影响房水外流，同时也可导致筛板区域僵硬，使得视神经更容易在高眼压的作用下受到损伤[30]。低氧处理后的小梁网以及青光眼患者小梁网，相较健康人小梁网，表现出全基因组DNA甲基化水平增高，伴随TGF-β1表达的增高、抗纤维化相关因子RASAL1的表达下降。用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷处理青光眼患者小梁网，DNMT1、TGF-β1 的表达下降，RASAL1的表达增加，Ⅰ型胶原蛋白减少，即小梁网纤维化水平降低[31]。类似的，青光眼患者的筛板细胞与健康人的筛板细胞相比，也存在全基因组的DNA甲基化水平增高，同时TGF-β1启动子区域甲基化水平降低，TGF-β1和DNMT1表达增高[32]。另外Chansangpetch等[33]发现原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)、原发性闭角型青光眼(primary angle closure glaucoma，PACG)以及继发性青光眼患者中小梁网切除标本与健康人相比，均存在Alu序列的低甲基化，同时POAG患者中还存在HERV-K序列高甲基化。他们认为这些散在重复序列的异常甲基化可能与小梁网的纤维化表型相关[33]，提示除了TGF-β信号通路，DNA甲基化还可能通过其他方式参与青光眼的眼组织异常纤维化的病理过程。

3 组蛋白修饰与青光眼

3.1 组蛋白修饰及组蛋白乙酰化组蛋白是协助DNA包装形成核小体的碱性蛋白，包括球状的C端结构域和未折叠的N端尾[8，10]。由核心组蛋白的氨基酸残基组成的N端尾突出于核小体之外，是组蛋白修饰的主要区域。常见的组蛋白翻译后修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、类泛素化等[17]。不同的组蛋白修饰通过激活转录或者抑制转录，调节基因表达，指导细胞分化。其调节转录的机制主要：(1)组蛋白修饰导致核小体净电荷变化，改变核小体内或核小体间DNA-组蛋白的相互作用，影响染色质结构；(2)组蛋白修饰位点可以被其他蛋白质，即效应蛋白识别和结合，影响染色质功能；(3)一些组蛋白修饰可以直接影响染色质的高级结构；这三种机制并不是孤立的，它们可以同时参与到特定组蛋白修饰的作用中去[34-35]。

组蛋白的乙酰化是最重要的组蛋白修饰机制之一。乙酰基转移酶(histone acetyltransferase，HAT)催化的乙酰化和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)催化的去乙酰化共同维持了组蛋白乙酰化水平的动态平衡。核心组蛋白H3、H4尾端带正电荷的赖氨酸残基是乙酰化主要的作用靶点，乙酰化可以消除赖氨酸残基的正电荷，干扰组蛋白和DNA之间的相互作用，使染色质稳定性降低，有利于激活转录[9]；相反，组蛋白去乙酰化则增加染色质稳定性，抑制转录[36]。

3.2 组蛋白高乙酰化参与小梁网异常纤维化青光眼患者的小梁网与健康人小梁网相比，存在总蛋白和组蛋白H3乙酰化水平的增加。使用TDP-A(HDAC抑制剂)处理后的正常小梁网细胞出现上述同样的改变，TDP-A处理后，体外培养的小梁网细胞TGF-β2启动子的乙酰化水平增高，TGF-β2的表达增加；TDP-A处理灌注离体培养的牛眼后，TGF-β2表达上升，细胞骨架蛋白、细胞外基质增加，眼压增高。因此，组蛋白高乙酰化导致TGF-β2表达上调可能是青光眼小梁网损伤的重要机制[37]。

3.3 组蛋白乙酰化调节视网膜神经节细胞凋亡视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的死亡是所有类型青光眼共同的病理机制。神经元(包括RGCs)损伤后凋亡的一系列事件包括全基因组组蛋白的去乙酰化、基因的异常沉默、异染色质的形成以及核结构的收缩和瓦解[38]。对小鼠进行视神经损伤处理后，RGCs中HDAC2、HDAC3表达增多、活性增加，启动子区域组蛋白H4广泛去乙酰化导致一系列基因如Thy1、Fem1c、Brn-3b沉默，RGCs凋亡[39]。证明HDACs的过度激活导致组蛋白，尤其是位于基因启动子区域的组蛋白去乙酰化，正常基因表达被沉默，这可能是RGCs凋亡早期的重要过程。在RGCs凋亡过程中主要发挥作用的HDAC家族成员是HDAC3，其具有选择性的神经毒性作用[38]。许多实验证实，将HDAC抑制剂，如TSA、MS-275、RGFP966等，通过腹腔或皮下注射的方式注入小鼠体内，可以减少视神经损伤后的RGCs凋亡[39-42]。HDAC抑制剂的视神经保护机制可能是通过抑制HDAC的活性，改变组蛋白乙酰化水平，进而影响关键基因如p53的表达水平，改变下游细胞凋亡的相关通路，减少RGCs凋亡[43]。

4 miRNAs与青光眼

4.1 miRNAsmiRNAs是含有18～20个核苷酸的短链非编码RNA，miRNAs与目的基因信使RNA(mRNAs)的3’ 非翻译区(3’UTR)结合后，介导mRNAs的降解或转录后水平的基因沉默[9]。近年来，越来越多的miRNAs及其作用的靶基因被发现，miRNAs可以直接作用于超过30%的人类基因，可在几乎所有的生命进程中发挥作用，包括细胞周期的调节，细胞的生长、分化和凋亡等[17]。Ghanbari等[44]进行的一项全基因组miRNAs相关基因位点变异的研究显示，POAG与对照存在411个miRNAs位点变异，另外有47个miRNAs结合位点的变异与POAG表型显著相关，其中两个变异位点分别影响了miR-138-3p和miR-323b-5p对CDKN2B的调节作用。

4.2 miRNAs与小梁网功能障碍多个miRNAs家族参与调节青光眼病理进程中TGF-β信号通路变化。一系列实验发现，miR-29家族在小梁网细胞外基质的生成过程中与TGF-β2相互调控：TGF-β2增多会下调miR-29，而过表达miR-29b也会降低TGF-β1的表达，从而减少包括Ⅰ型胶原蛋白在内的多种细胞外基质组分的产生，阻止细胞外基质的沉积和重塑[45-48]。病理状态下，小梁网中的miR-29减少，可导致TGF-β信号通路失调，细胞外基质异常增多[46]。TGF-β/Smad通路是TGF-β信号通路中的一条，可以调节小梁网中细胞外基质关键成分如纤连蛋白、胶原蛋白、层粒连蛋白的沉积，导致眼压的增高。利用氧化条件处理小梁网，可使miR-483-3p下调，激活TGF-β/Smad通路，最终导致细胞外基质表达增多[49]。此外在周期性机械应力刺激下，小梁网中miR-24下调，导致调节TGF-β通路的FURIN蛋白表达下调，TGF-β上调，细胞外基质增加[50]。上述研究表明，miR-29b、miR-483-3p、miR-24在青光眼的病理过程中表达均下调，并最终均引起了细胞外基质的沉积，故这些miRNAs有希望作为青光眼治疗的新靶点。

除了纤维化，miRNAs还在小梁网的炎症反应等许多病理过程中发挥重要作用。例如，实验研究证实miR-204参与多种病理过程：将miR-204转染人小梁网细胞，结果包括抑制凋亡相关基因Bcl2l2/Bcl-w、cIAP1/BIRC2在内的5种基因下调，从而导致细胞凋亡增加、有害蛋白聚集增多、内质网应激反应减少、炎症介质表达增加等病理过程[51]。而与此相反，许多miRNAs在疾病进展中起保护作用，如在衰老小梁网细胞模型中，miR-146a的上调可以限制衰老细胞中炎症介质的产生，减少其对周围组织的损伤[52]。miR-200c可以直接通过转录后沉默作用抑制一系列可使小梁网收缩的基因，将miR-200c转染小鼠前房可以显著降低眼压[53]。另外，2项最新研究表明，POAG患者房水中miR-125b-5p、miR-302d-3p、miR-451a、miR-518d、miR-143和miR-660的表达与对照组存在显著差异，剥脱性青光眼(pseudoxfoliation syhdrome,XFG)患者房水中存在miR-122-5p、miR-3144-3p、miR-320a、miR-320e和miR-630的表达改变。这些miRNAs在青光眼发病中的作用尚待进一步明确，可能与调节细胞增殖、细胞间的黏附连接、细胞外基质重塑等生理和病理过程有关[54-55]。

4.3 miRNAs调节RGCs凋亡与正常小鼠相比，高眼压青光眼小鼠模型的视网膜中8个miRNAs(miR-181c、miR-497、miR-204、let-7a、miR-29b、miR-16、 miR106b、miR-25)显著下调，miR-27显著上调，这些miRNAs的靶基因与细胞外基质合成、细胞增殖、免疫反应和凋亡调控过程相关[56]。对比分析12个POAG和6个白内障患者的视网膜miRNAs表达谱发现，不仅POAG和对照组之间存在miRNAs表达差异，视野中度和重度损伤的POAG患者之间也存在16个miRNAs的表达区别[57]，说明miRNAs在青光眼视神经损伤过程中发挥重要作用。一些miRNAs可以起到视神经保护作用，如miR-187通过作用于Smad7阻止RGCs的凋亡，促进细胞增殖[58]。另外一些miRNAs则参与视神经损伤机制[59]。研究表明，在H2O2诱导的高氧细胞模型中，miR-100拮抗剂可以显著下调miR-100的表达，阻止RGCs的凋亡[60]。因此，调节miRNA可能成为青光眼视神经损伤治疗的新思路[59]。Mead等[61]发现，将骨髓间充质干细胞分泌的小细胞外囊泡注射进青光眼小鼠的玻璃体腔进行治疗，具有视神经保护作用，而这一作用依靠细胞外囊泡中包含的miRNAs。该研究将细胞外囊泡与miRNAs相联系，展示了一种利用细胞外囊泡作为载体，装载miRNAs进入眼部进行青光眼治疗的可能性。

5 总结与展望

表观遗传调控作为基因的细胞特异性表达的重要调控机制，在青光眼这一复杂性疾病的发病过程中起重要作用。表观遗传3种主要机制：DNA甲基化、组蛋白修饰以及miRNAs通过影响小梁网和视神经相关基因的特异性表达，参与青光眼发病过程。三者均参与到小梁网的纤维化、氧化和老化等病理过程中，导致房水流出受阻，眼压增高。另外三者还均参与了筛板纤维化以及RGCs凋亡的调节。尽管近年来有关表观遗传学参与青光眼发病的研究逐渐增多，但是由于表观遗传调控的复杂性，其参与青光眼发病的确切机制仍需进一步研究。值得注意的是，表观遗传的改变是可以逆转的[9]，因此应用表观遗传学的手段，如DNA甲基化抑制剂、HDAC抑制剂以及调控miRNAs表达水平等方法可能会成为未来青光眼治疗的方向。