NLRP3炎症小体在颅脑损伤中的研究进展

姚 凯，梁洪生，徐田野，蔺 铁，张相彤

(哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科，哈尔滨 150001)

颅脑损伤是一种中枢神经系统的损伤性疾病，钝性创伤或机械力创伤会造成暂时性或永久性脑功能损伤。颅脑损伤是导致全球儿童和青少年死亡和致残的主要原因之一。引起颅脑损伤的因素主要包括车祸、运动和暴力等。轻度颅脑损伤也常导致神经功能减弱或短暂性受损[1]。颅脑损伤的发病机制非常复杂，包括原发性颅脑损伤和继发性颅脑损伤两个病理发展阶段。原发性颅脑损伤是外力直接作用于头部导致的脑组织损伤，根据受伤机制分为局灶性损伤和弥漫性损伤，通常两种损伤并存。暴力直接作用导致以闭合性颅脑损伤、贯穿伤、挤压伤为代表的局灶性损伤，主要表现为脑挫裂伤和脑血肿。弥漫性损伤由加速- 减速性损伤通过对脑组织的旋转以及剪切作用力引起，以弥漫性轴索损伤最常见[2]。继发性损伤在原发性损伤后立即发生，可持续至损伤后数周，并可由兴奋性毒性、脑水肿、缺血和神经炎症等引起。谷氨酸释放增加诱导钙离子进入神经细胞，引起一系列病理损害，包括代谢应激、线粒体损伤、活性氧类(reactive oxygen species，ROS)的积累、钙诱导的钙蛋白酶水解以及内皮细胞和神经元的一氧化氮合酶的激活，导致一氧化氮增加[3]。近年来，中枢神经系统核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide- binding oligomerization domain- like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体的作用逐渐引起人们的关注，NLRP3炎症小体可通过调节炎症反应参与继发性颅脑损伤的过程。现就NLRP3 炎症小体在颅脑损伤中作用的研究进展予以综述。

1 NLRP3炎症小体概述

固有免疫是对病原体入侵的即时保护作用和免疫反应，包括物理屏障、循环蛋白(主要是补体系统)、免疫细胞(如单核细胞和中性粒细胞)以及固有免疫细胞表达的模式识别受体[4]。目前已知的模式识别受体包括Toll样受体、RIG- I样受体、C型凝集素样受体、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide- binding oligomerization domain- like receptor，NLR)4种[5]。NLR是一类细胞溶质传感器或受体，能够识别各种微生物的病原体相关分子模式，如脂多糖、病毒蛋白、病原体RNA和DNA，还可识别组织损伤过程中产生的损伤相关分子模式，如ATP和高迁移率族蛋白B1[6]。

研究最广泛的NLR包括NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRC5、NLRP6、NLRP7、NLRP12以及称为黑色素瘤缺乏因子的非NLR，其中NLRP3炎症小体是研究最多的中枢神经系统炎症小体，但NLRP3的精确调控机制仍不清楚。NLRP3炎症小体由NLRP3、凋亡相关斑点蛋白(apoptosis associated speck- like protein，ASC)、衔接蛋白和下游胱天蛋白酶1前体组成[7]。

NLRP3的C端由亮氨酸富集结构域组成，可能抑制NLR的蛋白功能，使其处于静息状态，NLRP3受到刺激可发生构象改变。中心核苷酸结构域是NLR蛋白的主要功能部位，炎症小体活化后形成低聚体，N端由热蛋白结构域组成，通过同型蛋白的相互作用启动下游信号[8]。当受到病原体相关分子模式或损伤相关分子模式刺激时，NLRP3炎症小体活化,并与ASC通过热蛋白结构域连接，然后招募胱天蛋白酶1前体，通过胱天蛋白酶募集域连接ASC与胱天蛋白酶1前体，从而产生有活性的胱天蛋白酶1的p10和p20片段[9]。随后，活化的胱天蛋白酶1将无活性的白细胞介素(interleukin，IL)1β前体和IL- 18前体分别转化为活化和分泌形式的IL- 1β 和IL- 18，细胞因子启动或扩增不同的下游信号通路，并驱动炎症反应，导致细胞损伤，发生细胞焦亡[10]。

2 NLRP3炎症小体的激活机制

2.1NLRP3的经典激活途径 经典NLRP3炎症小体激活需要转录和低聚反应两个平行且独立的步骤[11]。第一步：受固有免疫信号调节，主要由Toll样受体髓样分化因子88或细胞因子受体，如肿瘤坏死因子受体介导，通过核因子κB活化激活IL- 1β 前体和NLRP3转录[12]。第二步：NLRP3发生低聚反应活化胱天蛋白酶1，导致IL- 1β和IL- 18的加工和释放[13]。与感染有关的各种刺激(包括细胞外ATP增加、细胞外渗透压改变、β淀粉样蛋白表达、钾离子外流、ROS激活以及组织蛋白酶去泛素化)可通过启动NLRP3、衔接蛋白ASC和胱天蛋白酶1前体多蛋白复合物的合成来促进NLRP3炎症小体的低聚反应和活化[14]。研究表明，胱天蛋白酶1能够切割细胞焦亡的效应蛋白Gasdermin- D(GSDMD)，并将其裂解为GSDMD- N结构域和GSDMD- C结构域，从而破坏C端结构域对GSDMD的抑制作用，N端结构域能够与质膜的磷酸肌醇结合产生内径12～14 nm的膜孔，导致细胞肿胀和裂解，在细胞焦亡过程中起关键作用[15]。

2.2NLRP3的非经典激活途径 除经典NLRP3炎症小体激活外，还存在依赖胱天蛋白酶11的非经典NLRP3激活途径，特别是革兰阴性菌，即柠檬酸杆菌、大肠杆菌、嗜肺军团菌、鼠伤寒沙门菌和霍乱弧菌激活Toll样受体4- 髓样分化因子88和β干扰素TIR结构域衔接蛋白通路，同时发生核因子κB核转位，从而上调NLRP3炎症小体各组分以及 IL- 1β 和IL- 18的表达，促进干扰素调节因子3和干扰素调节因子7基因转录[16]。随后，干扰素调节因子3/干扰素调节因子7复合物可诱发α/β干扰素的表达，并与α/β干扰素受体1和α/β干扰素受体2 结合，从而激活Jak- STAT信号转导途径，促进胱天蛋白酶11基因的转录[17]。胱天蛋白酶11前体识别革兰阴性菌的脂多糖后，形成脂多糖/胱天蛋白酶11分子复合体，复合体低聚化形成非经典炎症小体，并激活脂多糖- 胱天蛋白酶11炎症小体。活化的胱天蛋白酶11不直接切割促炎细胞因子前体，而是通过未知机制激活NLRP3- ASC- 胱天蛋白酶1途径促进IL- 1β的加工和释放[18]。此外，胱天蛋白酶11能够将GSDMD裂解为C端结构域和 N端结构域，N端结构域诱导细胞焦亡的发生[15]。

经典与非经典的NLRP3炎症小体激活途径独立发生。胱天蛋白酶11在特定刺激条件下能够增强经典途径胱天蛋白酶1的活化进程，并促进IL- 1β和IL- 18的产生[19]。还需要通过进一步的体外实验对胱天蛋白酶1和胱天蛋白酶11之间的相互作用分子机制以及胱天蛋白酶11激活非经典途径或间接激活经典NLRP3炎症小体途径的作用机理进行研究。

3 颅脑损伤激活NLRP3炎症小体介导的炎症反应

NLRP3炎症小体通过诱导炎症反应参与颅脑损伤疾病的发生发展过程，调节神经炎症反应和细胞炎性坏死，其可能成为改善患者预后的关键因素。在中枢神经系统中，固有免疫反应在组织损伤或病原体入侵的病理过程中起重要作用，称为神经炎症反应，以小胶质细胞和星形胶质细胞活化为主要特征[20]。颅脑损伤后固有免疫反应能够促进神经组织修复，并加重继发性损伤。固有免疫反应对神经组织的破坏和修复主要取决于脑损伤所引起免疫反应的性质、持续时间和级联反应的程度[21]。神经炎症反应在颅脑损伤过程中起重要的作用，如果控制不当，可能进一步加重继发性脑损伤，导致进行性神经退行性病变，颅内高压、脑水肿甚至脑疝，加剧神经功能的缺失[22]。研究发现，NLRP3炎症小体广泛参与神经系统的固有免疫反应，在调节脑外伤后神经炎症反应信号通路中起关键作用，有望成为治疗颅脑损伤的重要靶点[23]。

严重颅脑损伤患儿脑脊液中NLRP3浓度明显升高，其浓度在损伤后第一天达峰值，第二天下降，第三天再次升高，且脑脊液NLRP3浓度较高患儿的预后较差[24]。有研究发现，颅脑损伤患者血清样本中ASC和胱天蛋白酶1的蛋白质水平升高，脑脊液样本中ASC和IL- 18的蛋白质水平升高[25]。综上所述，预后较差的颅脑损伤患者脑脊液中NLRP3、ASC、IL- 18的以及血液中胱天蛋白酶1的水平均有升高，可见炎症小体蛋白NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1、IL- 18可作为颅脑损伤患者血清和脑脊液的生物标志物，通过检测生物标志物含量的变化预测颅脑损伤患者的预后。原发性损伤或大量神经细胞死亡可能导致早期促炎因子的升高，而后期的促炎因子浓度升高可能与颅内压升高、感染或其他导致炎症小体激活的触发因素引起的细胞应激反应有关。

Liu等[26]发现，颅脑损伤大鼠的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中均有大量NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1的表达，炎症小体各组分信使RNA及蛋白水平在大鼠颅脑损伤后数小时内逐渐增加，表明NLRP3炎症小体在早期颅脑损伤加剧神经炎症反应的过程中起重要作用，由此可见，早期颅脑损伤阶段炎症小体信使RNA水平较蛋白水平更敏感。既往有学者认为，小鼠颅脑损伤后NLRP3炎症小体主要表达于小胶质细胞，并不在神经元和星形胶质细胞中表达[23]。Gustin等[27]研究表明，功能性NLRP3炎症小体不仅在小鼠脑组织小胶质细胞中表达，还在星形胶质细胞和神经元中表达。Wei等[28]研究表明，小鼠颅脑损伤后6 h，脑水肿量显著增加，24 h脑水肿量达到峰值；且在损伤后24 h，NLRP3、ASC和胱天蛋白酶1的信使RNA水平和蛋白水平都显著增加，脑组织中IL- 1β和IL- 18的浓度也增加。由于损伤后脑水肿达到最高峰时，NLRP3炎症小体各个组分的表达显著增加，故推测NLRP3炎症小体所调节的IL- 1β表达可能与创伤性脑水肿密切相关。

4 抑制NLRP3炎症小体各组分在颅脑损伤中的作用

NLRP3炎症小体在颅脑损伤中起关键作用，通过使用NLRP3炎症小体抑制剂或基因敲除炎症小体蛋白可以阻止NLRP3和ASC寡聚化诱导的胱天蛋白酶1活化，抑制下游促炎细胞因子IL- 1β和IL- 18的成熟和释放，从而减轻神经炎症反应，并提供神经保护作用。除炎症小体抑制剂外，一些神经保护剂(如ω- 3脂肪酸)可以通过干扰NLRP3的其他激活途径抑制其表达。

实验证实，ω- 3脂肪酸明显抑制了控制性皮质损伤大鼠的IL- 1β分泌和胱天蛋白酶1活化，ω- 3脂肪酸通过G蛋白偶联受体40(G protein- coupled receptor 40，GPR40)抑制控制性皮质损伤诱导的炎症，减少神经元死亡，减轻脑水肿和神经功能缺失[29]。研究表明，β抑制蛋白2是GPR40的下游蛋白分子，ω- 3脂肪酸可通过激活GPR40和β抑制蛋白2消除NLRP3炎症小体诱导的炎症反应[30]。GPR40作为ω- 3脂肪酸受体可通过与GPR40结合抑制神经炎症反应。对NLRP3上游调节蛋白GPR40和β抑制蛋白2的探索有望成为新的抑制神经炎症反应的研究方向。

敲除NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2，NOX2)基因或使用抑制剂能够降低颅脑损伤小鼠NLRP3、ASC、胱天蛋白酶1和IL- 1β的表达，减少硫氧还蛋白相互作用蛋白/NLRP3复合体形成，还可减少神经元死亡和损伤灶大小[31]。NOX2通过诱导大量ROS生成激活NLRP3炎症小体，硫氧还蛋白相互作用蛋白被ROS类激活后与NLRP3结合，导致NLRP3炎症小体激活[32]。敲除NOX2基因可以抑制NLPR3炎症小体激活，可能由NLRP3和硫氧还蛋白相互作用蛋白相互作用减少所致。NLRP3炎症小体的活化受多种信号调节，其中线粒体功能障碍导致产生的ROS对NLRP3的激活非常重要，ROS的活化被认为是组装NLRP3炎症小体的上游活性信号，可见NOX2/硫氧还蛋白相互作用蛋白/NLRP3的相互作用可能是NLRP3炎症小体激活的关键调节机制。

有研究表明，ASC抗体可干预液压冲击伤大鼠炎症小体的合成，并显著减少胱天蛋白酶1和IL- 1β的活化，从而缩小大鼠脑组织损伤灶的体积[33]。相关实验证实，胱天蛋白酶1抑制剂(Ac- YVAD- cmk)可抑制颅脑损伤小鼠的炎症小体中关键亚基胱天蛋白酶1以及下游促炎因子IL- 1β、IL- 18的释放，胱天蛋白酶1抑制剂还可降低裂解的GSDMD的表达，从而减少细胞焦亡[34]。

NLRP3炎症小体是调节炎症反应的重要复合体，炎症小体衔接蛋白ASC抗体和胱天蛋白酶1抑制剂都可以阻断炎症小体的活性。细胞焦亡是一种依赖胱天蛋白酶1的炎症细胞坏死，可能是颅脑损伤后最主要的神经细胞死亡方式。因此，抑制焦亡可能减轻颅脑损伤导致的血脑屏障破坏、脑水肿和炎症反应，并促进损伤后神经功能恢复。新的治疗靶点可为颅脑损伤诱导的神经炎症反应提供新的治疗方式。

5 NLRP3炎症小体下游炎症因子在颅脑损伤中的作用

IL- 1β和IL- 18与多种神经系统疾病有关，NLRP3 炎症小体可通过促进下游炎症因子IL- 1β和IL- 18释放诱导神经炎症反应。研究表明，IL- 1β与颅脑损伤后脑水肿的形成有关，可进一步破坏血脑屏障，并活化炎症细胞[28]。因此，IL- 1β作为NLRP3炎症小体介导的炎症反应中关键的下游炎症因子，其产生加剧了颅脑外伤后炎症引起的继发性损害。尽管生物体内的炎症反应作为天然防御反应具有保护作用，但是促炎细胞因子的过度产生可能成为组织损伤的重要驱动力。因此，抑制过度炎症反应是改善颅脑损伤后神经功能必不可少的条件[35]。

对颅脑损伤动物实验模型的研究发现，升高的IL- 1β与脑损伤后脑水肿的发生密切相关[36]。研究表明，颅脑损伤后大鼠的大脑皮质中IL- 1β的浓度显著升高，而IL- 18的浓度在损伤后的6 h才逐渐增加，高渗0.9%氯化钠注射液能够抑制IL- 1β和IL- 18的表达，并减轻脑组织水肿程度，高渗0.9%氯化钠注射液可能通过降低星形胶质细胞中的Na- K- Cl 联合转运体的表达，从而减少IL- 1β的分泌，降低脑水肿程度[37]。IL- 1β和IL- 18均由炎症小体产生，在损伤的不同阶段具有不同的作用。

Flygt等[38]的研究表明，IL- 1β中和抗体能够抑制液压冲击伤引起的大鼠小胶质细胞或巨噬细胞的激活，减少成熟少突胶质细胞的死亡，改善所观察到的神经行为。IL- 1β作为一种最常见的促炎因子，通过IL- 1β中和抗体抑制其分泌已在颅脑损伤治疗中取得了显著进展。

目前重组IL- 1受体拮抗剂阿那白滞素正处于临床试验阶段，在脑卒中患者的治疗中显示出一定的治疗前景，应继续探索其在严重颅脑损伤患者治疗中的抑制神经炎症反应的作用[39]。目前，仍需对拮抗剂进一步的研究，以便了解其临床使用的优势和不足，并探索后期颅脑损伤患者临床试验及生物安全。

6 小 结

神经炎症是中枢神经系统的固有免疫反应，在继发性颅脑损伤阶段发挥关键作用。神经炎症过程具有双重作用，既可通过更新再生组织而获益，也可通过放大局部炎症而产生有害作用。炎症小体可以通过扩大炎症反应信号诱导中枢神经系统损伤，故炎症抑制剂和靶向炎症小体药物有望对神经系统疾病得以治疗起主要作用。NLRP3炎症小体抑制剂可通过抑制IL- 1β和IL- 18的分泌和活化调节促炎途径。未来还需要对NLRP3炎症小体各组分的活化和调节机制进行大量的基础研究，并侧重于对NLRP3炎症小体上游分子的研究，有效干预NLRP3炎症小体的组装，从而减少神经功能损害。