脑缺血后处理调节自噬保护缺血性脑卒中研究进展

郭艳侠,王 珏,冯 娟

(中国医科大学附属盛京医院神经内科，沈阳 110004)

脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，目前已成为全球第二大死亡原因，也是导致脑血管病患者残疾的主要原因[1]。缺血性脑卒中的发病率高，已成为研究热点。缺血性脑卒中治疗主要包括血管再通及药物治疗等。由于血管再通后的快速再灌注会加重组织细胞功能代谢障碍及细胞结构破坏，在缺血损伤的基础上进一步导致再灌注损伤，而药物治疗只能针对单一损伤机制，治疗效果欠佳。因而，近年来对于缺血性脑卒中治疗的研究主要聚焦于通过外源性干预措施激活内源性脑保护机制。由此产生了外源性机械干预治疗。脑缺血后处理是指在缺血再灌注后一定时间内，给予1次或多次短暂性缺血再灌注，使脑组织对前面较长时间的缺血产生耐受性[2-3]。脑缺血后处理发挥保护作用的分子机制尚不明确。随着人们对缺血再灌注过程中自噬机制认识的加深，对脑缺血治疗的保护机制研究也逐渐转向其对于自噬过程的调节，有研究认为，自噬可作为缺血以及药物预处理的最终效应器[4-5]。由此，缺血后处理可能通过调节自噬对缺血性脑卒中发挥保护作用。现对缺血后处理调节自噬在缺血性脑卒中过程中发挥的保护作用的研究进展予以综述。

1 脑缺血再灌注损伤对自噬过程的调节

一些应激状态如缺氧、能量缺乏、氧化应激、内质网应激及蛋白质的大量聚集可激活自噬，自噬可介导细胞质内的长寿蛋白被溶酶体降解清除[6]。目前已发现有三十多种自噬相关基因参与调节自噬过程，当缺血及再灌注时间较短时，自噬过程被激活[7-9]，而长时间的缺血或再灌注可抑制自噬[9]，即自噬的激活或者抑制受缺血及再灌注的强度及时间的影响。

尽管脑缺血再灌注损伤导致神经元内自噬的激活已被广泛证实，但自噬激活的作用尚不明确。自噬激活可以大量清除细胞内的蛋白质及细胞器[10]。在自噬性降解过程中，膜性结构形成的囊泡包裹蛋白质，囊泡与溶酶体融合，通过溶酶体酶使囊泡内容物被降解，并被重新利用[11-12]。除了蛋白质，线粒体、过氧化物酶体、高尔基体及内质网等细胞器也被自噬过程清除，对酵母的研究还发现，部分细胞核区域也可被自噬选择性清除[13]。因而，自噬可以通过清除细胞内损伤的细胞器、毒性代谢产物及细胞内的病原体，促进细胞内物质及能量的重新利用发挥保护作用。神经元自噬水平降低可以导致大量的神经元丢失，以及神经功能缺失，最终引起或者加重神经退行性疾病[14]，在新生鼠脑缺血缺氧性损伤中，激活自噬可减少神经元死亡，减轻脑损伤[15]，说明自噬的激活可对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。然而，自噬也可以通过过量的自我吞噬以及对于细胞内必需组分的降解或者与凋亡过程相互作用促进细胞死亡。在胚胎发育及激素依赖性肿瘤的治疗过程中，自噬呈现为一种细胞死亡形式[16]。在程序性细胞死亡过程中，凋亡作为Ⅰ型细胞死亡形式，而自噬则为与凋亡不同的Ⅱ型细胞死亡形式[17]，抑制自噬可减轻脑缺血再灌注损伤，对新生鼠进行选择性中枢神经系统自噬相关基因7敲除可阻碍缺血缺氧性脑损伤后胱天蛋白酶(caspase)依赖和非依赖性神经元死亡[18]。综上，脑缺血再灌注损伤可激活自噬，而自噬激活发挥促进细胞存活作用还是导致细胞死亡作用尚不明确，自噬的作用可能由缺血的时程、缺血强度以及再灌注的时间及强度决定。有研究认为，自噬在缺血与再灌注过程发挥不同作用。小鼠永久性脑缺血激活自噬发挥破坏性作用，而短暂脑缺血60 min再灌注后立即应用3-甲基腺嘌(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬可在再灌注24 h增加梗死体积，即再灌注过程中自噬的激活发挥保护作用[19]，而在心肌缺血再灌注损伤过程中，缺血过程中自噬的激活具有保护作用，再灌注过程中自噬发挥破坏作用[20]。在轻度刺激，如短暂缺血或者低度氧化应激情况下，自噬可以清除破坏的细胞器，促进大分子物质及能量的重新利用，维持细胞稳态促进存活，反之，长时间缺血及再灌注可导致过量的长时程的自噬激活，通过过量吞噬必需的细胞器和蛋白质导致细胞死亡[21]。

2 缺血后处理通过调节自噬过程发挥保护作用

研究证实缺血及药物后处理可通过抑制自噬发挥保护作用。永久性大脑中动脉闭塞时，后处理可通过抑制自噬发挥保护作用，大鼠永久性大脑中动脉闭塞后，立即应用3-MA，可在3 h后减低自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(light chain 3-Ⅱ，LC3Ⅱ)和组织蛋白酶B水平，24 h后增加Bcl-2水平，并在1、3、7 d减小梗死体积，改善神经功能[22]；新生鼠永久性大脑中动脉闭塞加颈总动脉夹闭90 min模型证实，在缺血后应用3-MA，可以减小46%的梗死体积，且可以抑制caspase依赖性与非依赖性凋亡[10]；大鼠永久性大脑中动脉闭塞加双侧颈总动脉夹闭30 min，可以激活自噬，缺血后立即应用3-MA，可抑制自噬，并减小缺血后24 h脑梗死体积及脑水肿[23]，在此模型中进行3个循环30 s再灌注，10 s颈总动脉夹闭作为缺血后处理，可在缺血再灌注后24 h减低LC3Ⅱ及Belin1蛋白水平，增加p62水平，减小梗死体积及脑水肿，后处理同时应用雷帕霉素，可激活自噬，减弱后处理的保护作用，而在缺血后应用3-MA可以增加Bcl-2水平，发挥与缺血后处理类似的脑保护作用[23]；全脑缺血后，药物后处理也可抑制自噬，大鼠10 min双侧颈总动脉夹闭模型模拟短暂全脑缺血，此后使用丙泊酚(50 mg/kg或100 mg/kg)进行后处理，可在缺血再灌注后12 h，减低LC3Ⅱ蛋白水平，减少自噬体及溶酶体，且增加存活神经元数量，缺血后10 min应用3-MA可发挥与丙泊酚类似的作用[24]，由于丙泊酚可与p53抑制剂，以及核因子κB抑制剂(SN50)发挥类似的抑制自噬和凋亡的作用，推测丙泊酚通过抑制核因子κB/p53通路，抑制自噬，保护短暂全脑缺血再灌注损伤[25]。体外实验也证实了后处理抑制自噬保护脑损伤的作用，使用PC12细胞氧糖剥夺模拟缺血再灌注，证实丙泊酚后处理可抑制自噬，增加存活神经元数量[24]。

然而，也有研究认为后处理通过激活自噬发挥保护作用。大鼠短暂局灶性脑缺血,大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)2 h，MCAO后立即或者再灌注10 min后，双侧股动脉夹闭10 min后再灌注10 min重复3次作为远端后处理，可在再灌注22 h减小梗死体积，改善神经功能，MCAO后立即进行远端后处理可增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，且LC3Ⅱ阳性的细胞多为神经元，远端后处理通过蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)/糖原合成酶激酶3B通路激活自噬[26]。心肌缺血30 min再灌注120 min后缺血后处理，可以激活自噬，应用3-MA可抑制自噬并废除后处理的保护作用。

3 后处理调节自噬过程机制

缺血后处理与自噬之间的关系尚不明确，但缺血后处理发挥保护作用的机制与自噬机制之间具有紧密的联系。

3.1哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR) mTOR是两种不同复合物mTOR复合物(mammalian target of rapamycin complex，mTORC)1和mTORC2的催化核心，两者都包含G蛋白β亚单位样蛋白和含有DEP序列区的雷帕霉素靶蛋白，此外各自由不同的功能蛋白组成。mTORC2的作用尚不明确，其可激活Akt及蛋白激酶C，参与细胞存活和细胞骨架的调节[27]。mTORC1可整合生长因子及营养信号激活其下游的S6K1和S6，抑制真核翻译起始因子4E结合蛋白1，影响蛋白质合成、细胞生长，以及核糖体的生物合成[28]，mTORC1还参与调节自噬过程，营养充足条件下，mTORC1可被激活，导致mTOR结合蛋白raptor与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1结合，使丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1及自噬相关基因13发生磷酸化进而抑制自噬。在应用雷帕霉素或者能量不足情况下，mTORC1的抑制会抑制自噬相关蛋白1以及自噬相关基因13的磷酸化，激活自噬[29]。心脏缺血损伤过程中，能量缺乏会导致ATP减少，增加腺苷一磷酸含量，由此激活腺苷一磷酸激酶,腺苷一磷酸激酶的激活会抑制mTOR活性，上调自噬[30]。此外，mTOR活性还受到Akt的调节，Akt磷酸化后可使结节性硬化症1/结节性硬化症2复合物发生磷酸化，并抑制其活性，结节性硬化症1/结节性硬化症2复合物活性的抑制可以激活Rheb，由此激活mTOR[31]，Akt还可通过抑制mTORC1的抑制物蛋白酶激活受体40，激活mTORC1[32]。Akt/mTOR通路可参与调节自噬过程，研究发现，心肌缺血再灌注损伤，乙醛脱氢酶的线粒体异构体的过表达可在缺血过程中诱导腺苷一磷酸激酶的激活，抑制mTOR,激活自噬，而在再灌注过程中，可通过激活Akt激活mTORC,抑制自噬[29]。将荷花碱应用于人肺癌细胞系A549，可以通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/Akt/mTOR通路，激活自噬，诱导自噬性细胞死亡，发挥抗癌作用[30]。

3.2自噬效应蛋白(Beclin1) Beclin1是一种与Bcl-2相互作用的蛋白，在哺乳动物细胞中可作为自噬的上游调节子。有研究认为Beclin1依赖性自噬的下调或者抑制可以在缺血再灌注损伤中发挥保护作用[33]。在大鼠MCAO模型中，在制备脑缺血模型前7 d侧脑室内注射Beclin1小干扰RNA减低Beclin1表达，抑制自噬，可在再灌注后14 d减小梗死体积，改善神经功能[33]；在心肌缺血再灌注损伤过程中Beclin1依赖性自噬的激活发挥破坏性作用[20]。然而，也有研究认为Beclin1依赖性自噬的上调具有保护作用，在大鼠脑中Beclin1的上调可以抑制辛德毕斯病毒的复制，并通过抑制凋亡，发挥对于神经元的保护作用[34]；在心肌细胞缺血损伤中，Beclin1的下调或者其与Bcl-2相互作用的增加会增加心肌细胞自噬[35]。因而Beclin1依赖性自噬在缺血再灌注损伤中的作用存在争议。

3.3PI3K PI3KⅠ和PI3KⅢ在自噬的调节过程中发挥不同的作用，PI3KⅠ可通过激活Akt/mTOR信号通路抑制自噬[36]，而PI3KⅢ与Beclin1以及其他的蛋白质形成复合物，聚集自噬体膜形成必需的蛋白诱导自噬[37]。大鼠永久性脑缺血，电镜发现自噬体和自噬溶酶体增加的神经元，同时显示细胞早期凋亡和坏死的形态学改变，使用PI3KⅢ抑制剂3-MA，可以减小梗死体积，脑水肿及神经功能损伤；大鼠全脑缺血后应用3-MA可抑制凋亡，抑制组织蛋白酶B的释放，发挥保护作用，提示PI3KⅢ介导的自噬在脑缺血损伤中发挥破坏性作用。然而也有研究认为PI3KⅢ介导自噬在缺血再灌注损伤中发挥保护作用，在脑缺血再灌注损伤前应用3-MA，可加剧脑损伤[38]。在缺血预处理前应用3-MA抑制PI3KⅢ，可抑制缺血预处理的神经保护作用。脑缺血后处理可以减小梗死体积，具有脑保护作用，mTOR抑制剂雷帕霉素会阻断缺血后处理的保护作用，而3-MA可模拟后处理的保护作用[15]；应用丙泊酚作缺血后处理可抑制自噬，减低PI3KⅢ的水平，增加存活神经元数量，发挥保护作用[25]。

3.4高迁移率组蛋白1(high mobility group protein B1,HMGB1) HMGB1为一种高度保守的非组蛋白核DNA结合蛋白，在大多数的真核细胞中表达，也可以表达于神经元[39]。细胞核内的HMGB1可与DNA结合促使核小体的稳定形成，并维持细胞核稳态。应激情况下，HMGB1可由损伤细胞(如激活的巨噬细胞，自然杀伤细胞，树突状细胞)主动分泌[40]，也可由损伤或坏死的细胞被动释放到细胞外[41]。创伤性脑损伤与缺血性脑卒中都可导致HMGB1的释放，在大鼠MCAO模型及缺血性脑卒中患者中都可以观察到血清中HMGB1水平的升高[42-43]。细胞外的HMGB1可通过与其受体的结合激活下游通路导致细胞因子及其他促炎因子的上调。近年来，多种药物可通过减低血清中的HMGB1水平对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用[44-46]。在不同部位表达的HMGB1都可以对自噬过程发挥调节作用，细胞核中的HMGB1通过上调热激蛋白β-1调节自噬及线粒体自噬过程中的膜平衡[47]，细胞质中的HMGB1通过与Beclin1结合诱导自噬[48]，细胞外的HMGB1可通过与其受体RAGE结合诱导自噬[49]。由此推测，脑缺血再灌注及缺血后处理可能通过HMGB1依赖性途径调节自噬过程。

3.5活性氧类 脑缺血再灌注损伤可以产生大量的活性氧类，活性氧类主要包括超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基。中枢神经系统中，超氧负离子最为重要，其由呼吸链产生，是黄嘌呤氧化酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的产物。超氧阴离子被超氧化物歧化酶催化转化为过氧化氢，过氧化氢在催化酶作用下转变为水和氧气。缺血再灌注过程中活性氧类的产生主要分为三个时相：①氧糖剥夺过程中，与线粒体去极化过程一致，当线粒体电位丢失时停止。氧糖剥夺可抑制线粒体呼吸复合物Ⅳ，导致呼吸链中间产物的积累以产生活性氧类。②氧糖剥夺后25～35 min，细胞内ATP消耗，导致腺苷酸核苷酸聚集形成次黄嘌呤和黄嘌呤，作为黄嘌呤氧化酶的底物，使黄嘌呤氧化酶激活导致大量活性氧类产生。③快速恢复血供时，组织氧合水平快速提高，导致活性氧类大量产生，此期的活性氧类产生主要由于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活[50]。活性氧类主要在再灌注后1 min内产生，而且是导致再灌注损伤的主要原因。活性氧类的产生可以激活自噬，使用脂多糖处理新生鼠心肌细胞可以增加活性氧类的产生并激活自噬[51]。在U87和HeLa细胞中，线粒体电子转移链复合物Ⅰ和Ⅱ的抑制可以增加活性氧类产生并上调自噬，活性氧类清除剂可抑制自噬[52]。后处理可减低缺血再灌注损伤过程中产生的过量的活性氧类，缺血后处理(2 h缺血后3个循环,每个循环30 s缺血加30 s再灌注)可以减小梗死体积、过氧化氢水平，增加超氧化物歧化酶、催化酶以及蛋白酶体活性，减少蛋白羧基衍生物，发挥保护作用[53]，与此同时，后处理的保护作用还依赖于氧化还原信号，脑缺血再灌注损伤后，肢体远端后处理可抑制蛋白激酶C，减小梗死体积，抑制凋亡，使用氧自由基清除剂会抑制后处理的保护作用[54]。则后处理可通过调控活性氧类，使缺血再灌注损伤后自噬维持在合适的水平，发挥保护作用。

3.6内质网应激 内质网在保证蛋白质的正确合成和折叠以及维持细胞内钙稳态中发挥重要作用，内质网所处环境或者其功能的破坏可诱导内质网应激，导致非折叠或者错误折叠的蛋白累积。内质网应激可以激活未折叠蛋白反应，通过内质网分子伴侣蛋白降解错误折叠的蛋白。研究证实，大鼠心脏缺血再灌注损伤会激活未折叠蛋白反应[55]，内质网应激累积的错误折叠蛋白通过蛋白酶体降解，过量的非折叠蛋白通过自噬降解，维持细胞稳态[56]。反之，细胞经历内质网应激时抑制自噬会导致细胞死亡[57]。严重缺血再灌注损伤会导致持续严重的内质网应激，此时，未折叠蛋白反应和自噬的作用由保护转为导致细胞死亡[58]。预处理可以通过激活自噬，抑制缺血再灌注过程中过度的内质网应激[59]，发挥保护作用。心肌缺血再灌注损伤，缺血后处理可抑制内质网应激，其机制可能是通过蛋白激酶C与钙感应受体相互作用[60]，抑制钙感应受体[61]，抑制p53上调凋亡调节因子[62]，并有丝裂原激活蛋白激酶、Jun激酶通路[63]的参与。也有研究表明心肌缺血后处理可激活内质网应激，心肌缺血后3个循环，每个循环10 s缺血加10 s再灌注后处理，减小梗死体积，应用免疫印迹实验检测蛋白含量发现葡萄糖调节蛋白78和激活的转录因子6增加，提示内质网应激增加，心肌缺血前1 h应用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸，消除了后处理的保护作用，减低后处理导致的葡萄糖调节蛋白78和激活的转录因子6增加[64],脑缺血再灌注损伤，后处理可以抑制内质网应激，大鼠大脑中动脉永久性闭塞及双侧颈总动脉闭塞30 min后处理，24 h后内质网应激蛋白及caspase-12明显减少，葡萄糖调节蛋白78增加[65]。推测后处理可通过抑制内质网应激，减少缺血再灌注损伤中过度的自噬，发挥保护作用。

3.7线粒体 损伤的线粒体表现膜电位降低，产生过量的活性氧类，激活自噬以清除活性氧类，即线粒体自噬，缺血再灌注过程中，线粒体可以释放促凋亡因子和细胞色素C，产生大量的活性氧类，导致凋亡和坏死，因而通过线粒体自噬清除损伤的线粒体可发挥保护作用。线粒体片段化和线粒体裂隙可以诱导线粒体自噬[66]，在缺血损伤时，线粒体裂隙产生于自噬上调之前，抑制缺血导致的线粒体裂隙可减少自噬[67]，此外，研究发现，心肌缺血再灌注损伤后，线粒体膜通透性转移孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的开放可诱导线粒体自噬，抑制MPTP会减弱自噬的激活[68]。严重的缺血再灌注损伤导致自噬大量激活，而过度的自噬会造成线粒体功能受损导致坏死或者凋亡[69]。缺血预处理可以通过使线粒体内膜轻度去极化，开放线粒体KATP通道或者短暂开放MPTP激活自噬发挥保护作用[70]。与预处理不同，缺血后处理可抑制MPTP的开放，阻止线粒体内膜膜电位的去极化，缺血后处理与MPTP抑制剂环孢菌素A都可减小梗死体积，改善神经功能缺失，MPTP的激活剂苍术苷会逆转缺血后处理的保护作用[71]。推测缺血后处理可能通过抑制MPTP的开放，增加缺血再灌注导致的线粒体膜电位的降低，抑制缺血再灌注过程中的过度自噬发挥保护作用。

4 小 结

由于自噬过程在脑缺血再灌注损伤中具有重要意义，缺血后处理作为发挥脑保护作用的重要措施，可通过多种途径及机制(其中包括mTOR，Beclin1，PI3K，HMGB1，活性氧类，内质网应激及线粒体等)调节自噬过程。然而，缺血后处理如何调节自噬过程，以及其通过自噬过程发挥对于缺血性脑卒中的保护作用的具体分子机制尚不明确，因而，研究缺血后处理对于脑缺血再灌注损伤中自噬过程的调节作用，及其发挥保护作用的具体机制至关重要。