YAP蛋白在大肠新生物发生发展中的研究进展

吕俊衍，李春媚，魏云华，马岚青

(昆明医科大学第一附属医院消化内科，昆明 650032)

我国是大肠癌高发国家，且发病率呈逐年上升趋势。据2015年中国癌症统计数据显示，大肠癌的发病率和病死率居所有恶性肿瘤前5位，每年大肠癌新发病例37.6万，死亡病例19.1万，已成为严重危害我国国民健康的疾病之一[1]。研究发现，腺瘤性息肉是大肠癌的癌前疾病，约85%的大肠癌源于腺瘤性息肉[2]。目前，大多数学者认可的演变过程为正常肠上皮→过度增生上皮→大肠腺瘤→大肠癌，此过程与一系列原癌基因(Kras和C-myc等基因)或抑癌基因[VHL(Von Hippel-Lindau)、APC(adenomatous polyposis coli)、p53等基因]的改变有关[3-8]。上述基因的改变可导致大肠上皮细胞过度增殖、分化并发生异常凋亡改变等，逐渐向恶性增生进展。YAP(Yes-associated protein)蛋白进入细胞核定植后，可作为共转录因子与转录因子TEADs(TEA domain family members)结合，同时还能协同β联蛋白，以激活与细胞增殖生长有关的原癌基因，并抑制凋亡相关基因，最终影响器官体积大小和肿瘤形成[9-11]。YAP蛋白作为致癌因子，可根据其在大肠肿瘤组织细胞内的表达水平判断瘤样新生物的良恶性程度，研究YAP蛋白高表达癌症的靶点治疗，进一步了解大肠癌的发病机制，为寻找有效的大肠癌治疗方法开拓新的方向。现就YAP蛋白在大肠新生物发生、发展中的研究进展予以综述。

1 YAP蛋白的结构与功能

YAP蛋白具有控制正常组织生长和维持器官体积大小的功能。YAP蛋白的功能首先在果蝇体内的YAP蛋白同源体Yki上发现，Yki位于果蝇hpo通路下游，作为共转录因子与TEAD/TEF家族转录因子Sd相结合，控制细胞凋亡抑制因子果蝇凋亡抑制蛋白1、细胞周期调节因子CycE等基因转录，以调控组织生长和维持器官体积大小，但其过表达则会使细胞增殖加强、凋亡减弱，导致肿瘤形成[12-14]。

Hpo通路及其靶因子Yki蛋白在进化中高度保守，在哺乳动物体内对应为Hippo通路和YAP蛋白，同时还存在结构与YAP蛋白相似、发挥类似功能的蛋白转录共激活因子PDZ结合基序[15-16]。YAP蛋白由人类染色体11q13上YAP基因编码，分子量为65 000，富含无DNA结合结构域的脯氨酸Yes相关磷蛋白，其上第94位丝氨酸，即S94形成TEAD集合区，第172～204位和第231～263位氨基酸分别形成2个WW结构域、1个SH3结合基序、1个coiled-coil结构域、1个转录激活结构域以及C端的PDZ结合基序[16-17]。转录因子，如Runt家族成员多瘤病毒增强子结合蛋白2、p53蛋白家族成员p73、TEAD/TEF转录因子家族、Smads家族蛋白、T-box家族成员Tbx5、Runt相关转录因子家族成员Runx2、表皮生长因子受体家族成员第2表皮生长因子受体酪氨酸激酶4等均可与YAP蛋白的各类结构域结合[18]。

YAP蛋白的5个保守HXRXXS基序中的丝氨酸可被上游大肿瘤抑制基因1/2直接磷酸化，其中磷酸化后的丝氨酸127位可与蛋白14-3-3结合，磷酸化后的丝氨酸381位可促进酪蛋白激酶1δ/ε进一步磷酸化YAP蛋白的其他位点，YAP蛋白可在384位和387位依次被磷酸化后滞留于胞质，并招募泛素连接酶的组分β-转导相容蛋白与其结合，引起YAP蛋白的多泛素化和降解，从而抑制YAP蛋白入核发挥功能[19-21]。胞质的YAP蛋白亦可通过WW结构域结合Smads家族蛋白，使其滞留于胞质而不能入核发挥转录因子作用，从而抑制转化生长因子β信号通路的激活，而未被磷酸化的YAP蛋白则可入核结合并激活转录因子来发挥作用[22-24]。TEAD/TEF是发挥主要作用的转录因子，可调节结缔组织生长因子、胶质瘤相关癌基因同源蛋白2、双调蛋白、survivin基因以及许多其他蛋白的基因表达，使细胞呈现加速增殖或凋亡抑制的状态。同时，激活的YAP蛋白和TEAD还能直接结合Lats2基因的启动子，通过磷酸化YAP蛋白和抑制其活性，形成Hippo通路的负反馈[25]。

有研究表明，介导细胞接触和连接的结构及复合物亦可协同作用Hippo通路[26]。如作为黏着连接成分用于连接细胞膜钙黏素与细胞骨架actin蛋白的α联蛋白可通过其PPXY基序或14-3-3蛋白的介导作用结合YAP蛋白并抑制其活性[26-28]。黏着分子血管生成抑制素结合蛋白(angiomotin，AMOT)家族可通过YAP蛋白的WW结构域和自身PPXY基序的相互作用招募YAP蛋白到胞膜紧密连接和actin蛋白处，通过相互结合使YAP蛋白定位在胞质，并激活大肿瘤抑制基因1/2，使YAP蛋白磷酸化，从而阻止其进入细胞核发挥促转录作用[29-31]。紧密连接蛋白2亦可通过PDZ结构域结合YAP蛋白将其阻滞在细胞核中，以发挥促进细胞凋亡的作用[32-33]。

2 YAP蛋白在肠上皮细胞更新及大肠肿瘤生成中的作用

YAP蛋白参与肠上皮细胞的发育过程，并发挥重要作用。研究发现，位于隐窝基底的干细胞首先迁移到腺腔内分化成瞬时扩增细胞，再分化成各种成熟的功能性细胞，并逐渐分布到绒毛中，进而遍布整个小肠表面[8]。内源性YAP蛋白多存在于肠道干细胞定居的腺窝区，在未分化的肠道细胞和干细胞中高表达，从隐窝基底部到上皮绒毛，其活性逐渐下降且出现核质异位[34-35]。肠道细胞YAP蛋白表达升高，肠道干细胞和祖细胞会增加，但多呈未分化状态。有研究发现，YAP蛋白活化后第5天的小鼠肠道杯状细胞和潘氏细胞缺失，随后，人大肠癌标本中也发现了类似YAP蛋白诱导的肠道组织细胞的发育异常，表明YAP蛋白的激活可破坏肠上皮细胞的正常发育和分化[36]。

大肠息肉的发展和癌变常伴随Kras、C-myc、β联蛋白等原癌基因的激活[37-38]。激活的YAP蛋白可作为共转录因子参与Kras、β联蛋白、蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路等原癌基因的启动活化，故认为YAP蛋白是大肠癌的致癌因子[39-41]。有研究证实，锯齿状腺瘤、家族性结直肠腺瘤性息肉病患者的结肠管状腺瘤和大肠癌组织中均存在YAP蛋白的异常增高和入核定植，但周边正常上皮组织内并未发现YAP蛋白的高表达和入核现象[42-43]。

3 在肠道新生物生成中YAP蛋白与β联蛋白的交叉协同作用

大肠癌多由结直肠黏膜上皮的良性瘤样新生物发展而来，大多数大肠癌都存在能引起Wnt信号通路过度活化的突变，其中以引起肿瘤抑制因子APC失活的突变最常见。可见，Wnt通路和APC蛋白在大肠新生物发生、发展过程中起重要作用。

β联蛋白是Wnt/β联蛋白信号通路中最重要的转录共激活因子。Wnt/β联蛋白信号通路激活时，β联蛋白的磷酸化和降解均被抑制，并在胞质不断积累，后转位入核与T细胞因子/淋巴增强结合因子特异性转录因子结合，激活与细胞增殖、凋亡及分化有关的靶基因表达survivin、C-myc、细胞周期蛋白D1等蛋白，导致细胞异常增殖，从而促进肿瘤的发生[44-45]。Wnt/β联蛋白信号通路受APC蛋白的负性调节，其失活可引发大肠癌。研究发现，YAP蛋白可与APC和β联蛋白相互影响，从而介导Hippo信号通路与Wnt/β联蛋白通路间的相互作用[46-47]。

β联蛋白可与YAP蛋白在抗凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病2相关蛋白1及survivin的启动子形成β联蛋白-YAP-Tbx5复合物，共同调节细胞增殖、凋亡及分化[48]。随后研究发现，YAP基因也是Wnt/β联蛋白通路的直接靶基因，β联蛋白与YAP基因的启动子结合调节YAP蛋白表达，抑制β联蛋白表达可导致YAP蛋白信使RNA水平减少。研究表明，过表达的YAP蛋白和β联蛋白可共同驱动大肠癌细胞的增殖[49-50]。

研究发现胞质中被Hippo通路磷酸化抑制的YAP蛋白可通过其TEAD结合区与β联蛋白的N端结合，使β联蛋白滞留在胞质，并抑制其活性和入核激活靶基因功能。上游使YAP蛋白磷酸化的哺乳动物不育系20样激酶1/2的失活可导致Wnt/β联蛋白活性增强，进一步说明YAP蛋白与β联蛋白具有交叉协同作用[51-52]。

APC作为β联蛋白的负性调节因子，亦是人大肠癌中突变率较高的肿瘤抑制因子[53]。在Wnt通路中，APC可抑制YAP基因转录，APC缺失可致YAP蛋白入核激活YAP-TEAD依赖的转录，并促进肿瘤的发展[46]。在APC突变小鼠结肠癌细胞中YAP蛋白被激活，敲除YAP基因后可抑制小肠和结肠中因APC突变引起的腺癌形成[41]。现已知APC对YAP蛋白的抑制调节有通过β联蛋白形成蛋白复合体下调YAP基因表达和通过联合Hippo通路级联磷酸化YAP蛋白两种机制[36,54]。

4 YAP蛋白在大肠癌“炎症-异型增生-肿瘤路径”的发生过程中的作用

“炎症-异型增生-肿瘤路径”是与经典“腺瘤性息肉-癌路径”不同的大肠癌发生机制。有研究表明，肠道干细胞可在葡聚糖硫酸钠和博来霉素诱导的损伤中上调Yki基因的表达，随后活化Yki蛋白激活Janus激酶，并协同细胞因子Upd产生促细胞增殖作用，从而阐述Yki基因介导细胞损伤时增殖修复发生的部分机制[55-56]。对小鼠的实验发现，正常状态下的YAP蛋白缺陷不会导致明显的肠上皮缺损，可见YAP蛋白并不是肠道生长发育过程的必需蛋白；但若对YAP蛋白缺陷小鼠使用葡聚糖硫酸钠，则会造成比YAP蛋白正常表达小鼠更严重的肠上皮损伤，可见YAP蛋白在肠道黏膜损伤后修复中起重要作用[43]。在肠道炎症反应(如溃疡性结肠炎)中，YAP蛋白作为原癌蛋白在胞质内浓度上升，并与β联蛋白进入细胞核内结合形成转录起始复合物，参与损伤上皮修复，但过度表达的YAP蛋白也诱导了息肉结构的形成，经免疫组织化学检查提示，其结构不同于APC缺陷所形成的息肉，随着上皮更新修复的持续进行仍可引起炎症相关性肠癌[57]。

5 YAP蛋白在大肠新生物诊疗中的研究进展

5.1YAP蛋白的表达对癌组织恶性程度及患者预后的预测作用 YAP蛋白可作为生物标志物运用于临床。有研究表明，YAP蛋白的表达量在大肠癌病灶周围正常组织、大肠腺瘤组织和大肠癌组织中依次递增，各组间差异有统计学意义[58]。手术切除大肠癌病灶并做淋巴组织清扫后发现，YAP蛋白表达量与附属淋巴结侵犯情况相关[59]。由此可见，YAP蛋白的表达可能提示大肠病变组织的恶性程度及大肠癌患者的预后。

5.2以YAP蛋白为靶点的癌症治疗进展 YAP蛋白有促进肿瘤发生发展的作用，在很多类型的癌症组织中高表达，可将YAP蛋白作为药物靶点应用于具有YAP蛋白高表达的癌症类型的治疗研究。YAP-TEAD复合物可激活大多数与YAP蛋白高表达相关肿瘤的原癌基因，故可对两者的结合进行干扰[60-61]。研究发现氟芬那酸作为常见的非甾体抗炎药，可与TEADs的疏水区结合，干扰YAP蛋白与TEADs的相互作用，从而抑制与YAP蛋白相关的转录和细胞增殖等[62]。转录辅助因子退变样蛋白4的Tondu结构域可与YAP蛋白竞争结合TEADs，从而抑制YAP蛋白相关肿瘤的生长，并基于转录辅助因子退变样蛋白4与TEADs相互作用原理，设计出了一种肽段用于干扰YAP-TEADs复合物的形成，抑制原发性胃癌细胞的生长，从而为YAP蛋白高表达的肿瘤治疗提供新的可能性[63]。经高通量筛选发现，维替泊芬能有效干扰YAP蛋白与TEADs的结合，并具有抑制YAP蛋白过表达引起的肝脏生长的作用[60]。

血管生成抑制素结合蛋白可促进YAP蛋白磷酸化，并可通过相互结合的方式阻止其入核，故可通过加强血管生成抑制素结合蛋白的作用来抑制YAP蛋白入核。研究显示，端锚聚合酶类可通过作用E3泛素连接酶RNF146促进血管生成抑制素结合蛋白的降解，故作为端锚聚合酶类抑制因子的XAV939，Wnt反应抑制剂1，G007-LK、G244-LM可发挥抑制血管生成抑制素结合蛋白降解的作用，从而间接拮抗YAP蛋白活性[64-66]。端锚聚合酶类抑制因子对YAP蛋白高表达肿瘤的治疗有一定潜力，但具体效果仍需进一步研究。

YAP蛋白可通过WW结构域与含有PPXY基序的蛋白结合，并发生相互作用[67-68]。研究显示，WW结构域与WW结构域结合蛋白2 结合可增强YAP蛋白的促转录作用，反之WW结构域的突变可抑制YAP蛋白促进原癌基因转录的作用[69-72]。故可使用能与YAP蛋白WW结构域结合的物质来抑制其致癌作用。有研究发现洋地黄可通过结合于WW结构域的疏水区来抑制肿瘤细胞中YAP蛋白的活性[73-75]。但有研究指出，大肿瘤抑制基因1和类血管生成抑制素结合蛋白1可与YAP蛋白的WW结构域结合，对YAP蛋白进行负性调节，如乳腺上皮细胞中WW结构域缺陷导致YAP蛋白激活，从而导致细胞迁移和转化，故以WW结构域为靶点治疗肿瘤增生，应考虑细胞组织环境的差异，否则可能激活YAP蛋白[29-30,32]。

6 小 结

随着对Hippo通路组成成分和YAP蛋白在肠上皮炎症反应和异常增生中表达的不断研究，YAP蛋白在结肠新生物生成以及向恶性肿瘤发展过程中的作用正逐渐被揭示。YAP蛋白作为原癌蛋白可直接上调增生相关基因的表达，亦可与其他涉及细胞增殖的信号通路相互作用，发挥促进细胞增殖的作用。近年来，通过作用YAP蛋白及其上下游分子抑制YAP蛋白活性，不断推进肿瘤生长变化的研究发现，抑制大肠癌细胞内过表达的YAP蛋白，肿瘤生长可出现不同程度减弱[60-66]。研究发现随着大肠新生物恶性程度的升高，细胞内YAP蛋白的表达量和核定植情况也在上升[58-59]。上述研究在分子层面进一步阐释了大肠癌的发生发展机制，同时提出了可用于研究大肠癌治疗的多个潜在靶点和预测肿瘤恶性程度标志物。因此，YAP蛋白和大肠肿瘤的关联性研究将为大肠癌的诊治提供新的视野。