CRTC1-MAML2在涎腺黏液表皮样癌中的研究进展

王 娟，吴发印,徐海丽

(遵义医学院第五附属(珠海)医院口腔颌面外科，广东 珠海 519100)

涎腺黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是涎腺中最常见的恶性肿瘤,约占所有恶性唾液腺的35%，占所有涎腺肿瘤的3%～15%,其中80%发生于腮腺，以细胞多形性为特点，包括表皮样细胞、中间细胞和黏液细胞[1]。目前发现除低剂量放疗或外伤可能有一定诱导作用外，MEC病因尚不明确,诊断方式存在缺陷，治疗方式还很有限。到目前为止，融合基因与肿瘤存在因果关系，已经发现的融合基因总数达两万多个[2]，在人类恶性肿瘤中20%发生基因融合[3]，其中多种融合基因被认为是肿瘤的重要诊断和预后标志物，并成为治疗的新靶点。融合基因CRTC1-MAML2[4]参与MEC的生长与维持，是目前在MEC中发现的唯一的细胞遗传学改变，超过55%的MEC存在这种融合基因，CRTC1-MAML2融合阳性MEC患者的存活率明显高于CRTC1-MAML2融合阴性MEC患者[5]。CRTC1-MAML2作为MEC中一个特定的分子标志物,为MEC靶向治疗提供了新的方向。现就CRTC1-MAML2融合基因在涎腺MEC的发生、诊断、治疗中的研究进展进行综述。

1 融合基因CRTC1-MAML2

1.1CRTC1-MAML2融合基因的来源与发现 融合基因CRTC1-MAML2[6]是由于染色体t(11;19)(q12;p13)的易位，导致在染色体19p13上的外显子基因CRTC1(也被称为TORC1，MECT1或WAMTP1基因)与染色体11q12上的MAML2基因断裂发生了融合产生。t(11;19)(q12;p13)的易位由Nordkvist等[7]发现并首先描述，目前CRTC1-MAML2基因(GenBank AY040324)的反复易位已被确定为大多数MECs的潜在遗传事件。CRTC1-MAML2融合基因在肺MEC[8]，泪腺MEC[9]，甲状腺[10]及皮肤汗腺瘤[11]中均有报道。Tirado等[10]分析了55例原发性唾液腺肿瘤，包括22例MEC，以确定CRTC1-MAML2融合转录本与肿瘤类型的关系，22例原发性唾液腺中18例(81%)和3例MEC甲状腺中1例融合转录呈阳性。在低、中、高水平以及低、高水平MEC中均检测到该转录本。22例原发性非MEC唾液腺癌的转录本均为阴性，虽然在55例唾液腺癌中11例沃辛瘤有4例(36%)的转录本呈阳性，但是研究证明CRTC1-MAML2表达阳性的沃辛瘤多为存在坏死和化生的特殊病例[12]。目前尚未在其他唾液腺癌中发现表达CRTC1-MAML2。随后亦未在其他唾液腺癌中得到证实。

1.2CRTC1-MAML2融合基因的功能 目前关于CRTC1-MAML2融合基因致癌机制的研究还有限。一个被广泛接受的致癌机制是：CRTC1-MAML2融合基因可以被划分为单独的模块域，每个组成元件都能够实现或执行特定的功能，每一个元件错乱都可能导致MEC的形成。CRTCs[13]是一个主要调节环腺苷酸效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)转录因子活性的蛋白质家族,是保证CREB活性的必需条件。其中CRTC1启动子在融合阳性MEC和少数正常成人唾液腺中有报道，但CRTC1蛋白在正常唾液腺的分布尚不清楚。Jaskoll等[14]的研究结果表明，CRTC1蛋白在早期的下颌下腺上皮细胞中表达，随着分化而消失，但在肿瘤样病理中重新出现，表明CRTC1可能在下颌下腺胚胎期形态发生过程中发挥作用，但对腺泡分化没有作用，研究支持MEC肿瘤的发生起源于前体细胞。CRTC1介导的细胞增殖可能在一定程度上参与了MEC的初始形成。CRTC1激活后引起下游特异性基因LYPD-3转录激活，从而参与肿瘤的发生与转移[15]。NOTCH信号通路是一种进化上保守的机制，在此机制中，细胞间的相互作用可能决定细胞的命运，在许多组织的发育过程中起重要作用。MAML2[16]是NOTCH转录复合体的一部分，是配体刺激后的转录因子DNA结合序列CSL(c-promoter binding factor-1/suppressor of hairless/LAG-1)和NOTCH受体的核激活形式，是NOTCH靶基因转录激活的必要条件。Behboudi等[17]对融合阳性MEC融合下游潜在靶点的分析显示，cAMP/CREB(FLT1和NR4A2)和NOTCH(HES1和HES5)靶基因在融合阳性和融合阴性MECs中的表达存在差异。

另外有研究认为只有CRTC1与MAML2融合才能导致MEC发生。Komiya等[18]的研究表明在肿瘤中强制表达CRTC1和MAML2不足以引发转化上皮细胞，而异位表达和(或)诱导表达CRTC1-MAML2则可转化上皮细胞。此外，与NOTCH配位相互作用所需的MAML2区域在CRTC1-MAML2融合蛋白中不存在，而异常调控CRTC1-MAML2信号的NOTCH基因也被发现具有CREB应答启动子。然而,CRTC1-MAML2融合则完全可以进行转化活动，激活CREB信号。Luk等[19]研究提示只有CRTC1与MAML2融合才可以有效诱导E1A永生的RK3E细胞内的病灶形成，而独立的MAML2、CRTC1并无此功能。进一步的研究认为，MECT1-MAML2融合基因和其蛋白产物可以通过激活cAMP-CERB信号通路和NOTCH信号通路破坏细胞周期和分化功能，或通过干扰NOTCH和CREB信号通路诱导肿瘤发生是CRTC1-MAML2融合基因的可能致癌机制[20]。双向调节因子(amphiregulin，AREG)是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)配体，已被证明是CRTC1-MAML2融合的下游靶点，在CRTC1-MAML2阳性MEC细胞系中发挥肿瘤生长和生存作用。Shinomiya等[21]采用逆转录聚合酶链反应检测33例MEC中CRTC1-MAML2融合基因，其中包括23例CRTC1-MAML2融合阳性，10融合阴性。在23例融合阳性病例中，17例(73.9%)和14例(60.9%)检测到AREG和EGFR过表达。在10例融合阴性病例中，1例(10%)和3例(30.0%)检测到AREG和EGFR过表达。CRTC1-MAML2融合与AREG过表达呈正相关，而与EGFR过表达无关。AREG表达的检测可能有助于识别CRTC1-MAML2阳性MEC。

2 CRTC1-MAML2融合基因与涎腺MEC的发生与维持

由染色体t(11;19)易位而产生的CRTC1-MAML2融合基因，在MEC中发生率为38%～82%[22]。将CRTC1-MAML2转染的RK3E细胞注入5只裸鼠体内，14 d内5只裸鼠均形成肿瘤，而未经CRTC1-MAML2转染的对照组30只裸鼠在3个月内未成瘤，证明了CRTC1-MAML2在大鼠上皮细胞RK3E细胞中的表达在裸鼠体内是致瘤的，切除的移植瘤继续表达融合癌基因，随后实验通过生成了一个RNA干扰载体，该载体选择性地抑制融合蛋白，导致至少90%的MEC细胞菌落生长抑制。与此相反，RNA干扰序列中单个核苷酸的改变使MECT1-MAML2蛋白的抑制能力消失，MEC肿瘤系的生长抑制作用全部消失，表明MEC的发生可能与CRTC1-MAML2的发生有因果关系，并且维持MEC的生长，使MEC有可能成为合理治疗靶点[18]。研究者用CRTC1-MAML2基因融合诱导培养上皮RK3E细胞的菌落形成，由此产生的转化型RK3E细胞能够在免疫受损小鼠中形成皮下肿瘤，表明在上皮细胞转化中CRTC1-MAML2融合基因的致瘤作用[23-24]。而通过内源性消耗CRTC1-MAML2的融合可显著降低体外MEC细胞及体内移植瘤的生长率和生存率，表明CRTC1-MAML2融合基因在MEC的发生和生长中的作用至关重要[25]。

3 CRTC1-MAML2融合基因在涎腺MEC中的应用

3.1诊断应用 细针穿刺细胞学常在术前作为唾液腺肿瘤的辅助诊断的一部分，为治疗方式的选择提供依据，但准确率仍存在争议，其在诊断高级或中级涎腺MEC较为准确，但对低等级肿瘤的诊断存在较大误差。融合基因CRTC1-MAML2的发现也为MEC的临床诊断提供了新的依据。目前已有案例成功证明了融合基因CRTC1-MAML2在MEC诊断上的意义，Fujimaki等[26]首次通过检测CRTC1-MAML2融合基因(用逆转录聚合酶链反应直接测序技术)确诊了MEC。Akaev等[27]报道了1例伴有强烈的肿瘤相关淋巴样增生的、CRTC1-MAML2表达阳性的特殊类型腮腺MEC，起初组织活检未检测到细胞内黏液蛋白，未见明确的表皮样细胞和黏液细胞，最终通过CRTC1-MAML2基因及其蛋白的检测得到确诊。也有研究证明在高等级MEC中有染色体t(11;19)(q12;p13)易位存在，当传统方法诊断困难时，通过检测融合基因的转录产物可能有助于区分肿瘤类型和分化较差的腺癌或透明细胞癌[28]。因此在诊断不明确的情况下应用分子技术检测CRTC1-MAML2融合基因及其转录蛋白可能会对MEC的诊断有所帮助。

3.2分级及预后应用 MEC曾被称为黏液表皮样肿瘤，第2版世界卫生组织头颈肿瘤分类中明确黏液表皮样肿瘤为恶性肿瘤，并按黏液细胞、中间细胞、表皮样细胞3种细胞的构成比例，将MEC分为低度恶性和高度恶性两级[29]。随后有学者结合其组织病理学特征将MEC划分为低、中、高三个级别，低等级的MEC是一个低风险的肿瘤，通过手术几乎可治愈，并且可以忽略淋巴结的转移。常用分级系统有3个:AFIP分级系统[30],Modified Healey分级系统[31]和Brandwein分级系统[32]。而在使用过程中评分系统选择不同肿瘤级别可能不同，如AFIP系统可能降低肿瘤的等级，通常高级别的MEC是侵袭性肿瘤，需要辅助治疗和颈部淋巴结清扫，而AFIP系统分级可能将具有侵袭性的肿瘤判定为低等级肿瘤，从而增加低等级肿瘤治愈的失败率[33]。而Brandwein系统可能增加高等级肿瘤患者，导致一些患者接受不必要的辐射或额外的手术。在临床中治疗方式的选择常根据肿瘤分级及术前活检或者术中冰冻活检来确定，而肿瘤分级方法选择的不同可能影响到术中手术方式及术后的处理，因此需要更客观的标志物来对肿瘤进行分级。

在MEC中CRTC1-MAML2融合基因多发现于低等级的MEC中并提示更高的生存率。Behboudi等[17]报道在CRTC1-MAML2融合阳性和融合阴性的MEC患者的中位生存时间分别是10.0和1.6年，融合阳性MEC患者局部复发、肿瘤转移的风险较融合阴性患者低[24]。Shinomiya等[21]研究在33例MEC病例中发现23例CRTC1-MAML2基因融合阳性，10例融合阴性，而融合阳性肿瘤的生存率高于融合阴性，并提出融合基因CRTC1-MAML2与TNM分类或临床分级无关，可为独立的预后预测因子。Jee等[34]用逆转录聚合酶链反应或荧光原位杂交技术检测28例MEC患者CRTC1、MAML2基因发现，CRTC1-MAML2基因融合率为64%，其中15种低等级中均存在融合基因，而13个高等级肿瘤中只有3例为阳性。在低等级肿瘤中,表达CRTC1-MAML2融合基因的MEC中没有或很少基因失衡，并具有良好的预后。而高等级MEC中,融合基因阴性的MEC中存在多个基因失衡，而且预后不佳，并频繁发生转移或复发。因此，MEC中的融合基因代表了肿瘤发生的一种独特机制。在此背景下，融合阳性MEC无论级别如何，都表现出更稳定的基因组，临床表现更倾向于良性肿瘤，而融合阴性MEC则表现基因组不稳定性和相对侵袭性肿瘤。在MEC中，CRTC1-MAML2的存在可能具有一定的预后价值。

然而，近来也有报道提出融合基因CRTC1-MAML2的表达与肿瘤等级、生存率之间无相关性。Birkeland等[35]报道90例病例中53例融合阳性，其中34例为低等级肿瘤，概率为64%(34/53)，与37例融合阴性病例中24例为低等级，概率为65%(24/37)，融合阳性与融合阴性病例中低等级率差异无统计学意义。认为先前的研究并没有在生存率评估中控制等级，可能会产生混淆效应。而进一步研究可能影响MECs肿瘤分级和存活的其他基因驱动因素是有必要的。综上所述，融合基因可以作为黏膜上皮癌的组织学评分的一个有用的辅助手段，并可能推动新的临床指导方针的发展，最终也将用于新的治疗策略[36]。

3.3治疗应用 MEC最常见的临床表现类似多形性腺瘤或其他良性肿瘤，呈持续数年慢慢扩大的无痛肿块。低等级恶性肿瘤的特征是缓慢增长的无痛肿胀；高等级肿瘤呈无痛性快速增长，浸润到邻近组织，并伴有远处转移，可能伴发疼痛或面神经麻痹。高等级MEC易发生远处转移，除淋巴结外，常见转移部位还有肺、脑和骨。唾液腺肿瘤的主要治疗方法是手术切除或结合术后放射治疗。对于出现局部晚期、复发或转移性疾病的患者，目前治疗方案主要是姑息治疗。据报道，MEC低、中、高级别肿瘤的5年总体生存率分别为92%～100%、62%、0%～43%[37]。对于高等级MEC生存率较低，治疗方式还很有限，而目前靶向治疗越来越成为研究热点，为MEC治疗也提供了新的思路，而CRTC1-MAML2的发现可能成为靶向治疗的目标。目前许多与融合致癌基因相关的肿瘤的靶向治疗已经取得一定的成效，如酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼治疗白血病[38]和克唑替尼治疗晚期非小细胞肺癌[39]等。CRTC1-MAML2融合基因在MEC中高表达，基于它在肿瘤发生和发展中的作用，为治疗方法提供了一种替代治疗方法。目前有研究表明吉非替尼可同时抑制MEC中激活的多种关键信号蛋白的磷酸化，其中部分是通过CRTC1-MAML2融合激活的JAK信号传导及转录激活因子和促分裂原活化的蛋白激酶/促分胞外调节蛋白激酶通路[40]。此外，吉非替尼对EGFR和促分裂原活化的蛋白激酶/胞外调节蛋白激酶通路的抑制作用强于蛋白激酶B、JAK2和信号传导及转录激活因子，且它们可以解除对CRTC1-MAML2的依赖。体外数据也显示存在染色体易位的MEC细胞系对吉非替尼敏感，其机制可能是通过CRTC1-MAML2上调EGFR配体的双向调节因子介导的[41]。因此，表达CRTC1-MAML2的MEC是吉非替尼治疗的有效靶点。有研究证明肺动脉MEC细胞系对酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼敏感[42]。然而，在MEC中，CRTC1-MAML2融合产物本身并不是一种酶。相反，它与其他蛋白酶、形式转录、激活复合物相结合，这些复合物参与调控通路。因此，治疗靶向性并不明确。治疗方面目前多关注于对NOTCH的抑制作用。MEC携带CRTC1-MAML2易位可能是酪氨酸激酶抑制剂治疗的有效靶点。

4 结 语

CRTC1-MAML2融合基因参与了涎腺MEC的发生、在MEC肿瘤的生长方面有一定维持作用、并与MEC肿瘤细胞的分化有一定的联系，CRTC1-MAML2融合阳性的MEC患者具有较好的预后及生存率。CRTC1-MAML2可作为MEC的特征性基因，辅助MEC的诊断。可将CRTC1-MAML2融合基因及其蛋白作为目标寻找新的靶向治疗，完善MEC的治疗方式上的缺陷。但是，目前关于CTTC1-MAML2的研究还有限，研究手段亦较局限，有些研究结论尚不统一。CRTC1-MAML2基因在与MEC的发生的具体机制，以及CRTC1-MAML2基因与MEC等级之间是否有关系，是辅助还是独立的关系，CRTC1-MAML2基因通过哪些信号转导通路调控MEC的侵袭转移，这些信号转导通路之间的关系如何等一系列问题，都有待于进一步的探索和研究。