NLRP3炎症小体与腹膜透析患者腹膜纤维化的研究进展

胡清华，罗绮媚，钟少鑫，窦献蕊

(南方医科大学顺德医院肾内科，广东 佛山 528300)

腹膜透析是以自身腹膜作为半透膜进行溶质和水跨膜转运的一种透析方式，具有可居家治疗、更好保护残余肾功能、对血流动力学影响小等优点，已逐渐成为终末期肾衰竭患者的首选治疗方法之一。腹膜结构和功能变化是影响腹膜透析治疗的关键因素，长期行腹膜透析治疗患者的腹膜普遍存在纤维化，腹膜纤维化引起的超滤衰竭是影响腹膜透析患者技术生存的重要因素[1]。目前，腹膜纤维化的发病机制尚未完全阐明。研究表明，腹膜炎与腹膜纤维化密切相关，腹膜透析相关性腹膜炎症包括微炎症状态和由感染引起的急性和慢性腹膜炎，两者结合是腹膜纤维化的主要原因，最终导致超滤衰竭[2]。Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体是近年来研究最多的复合体，可引起强效促炎因子白细胞介素(interleukin，IL)1β、IL-18的成熟和释放。现对NLRP3炎症小体参与腹膜透析相关性腹膜炎症和腹膜纤维化的机制予以综述。

1 NLRP3炎症小体及其激活模式

1.1NLRP3炎症小体的结构和功能 固有免疫系统可通过特定的模式识别受体识别入侵的微生物以及体内的危险信号，最终排除异己成分、保护宿主，炎症小体是固有免疫的重要效应因子。模式识别受体包括膜结合的Toll样受体和胞质内的Nod样受体。NLRP3是Nod样受体家族中研究最多的一种，可被多种刺激信号激活，并募集凋亡相关斑点样蛋白及胱天蛋白酶1组成多蛋白复合体——NLRP3炎症小体[3-4]。NLRP3蛋白由位于染色体1q44上NLRP3基因编码，包含1 016个氨基酸，分子结构包括C端、中央和N端3部分，C端是识别配体的亮氨酸富集结构域；中央为实现NLRP3寡聚化和活化的NOD结构域；N端为介导下游信号转导的热结构域[3]。凋亡相关斑点样蛋白作为一种衔接蛋白，其C端为结合NLRP3的下游信号转导的热结构域，N端为结合胱天蛋白酶1的CARD结构域。胱天蛋白酶1是前胱天蛋白酶1的活化形式，通过激活蛋白裂解使IL-1β、IL-18等细胞因子前体成熟，并发挥生物学效应。当内源危险信号刺激或外源病原毒素侵袭激活NLRP3时，与凋亡相关斑点样蛋白结合，并进一步募集前胱天蛋白酶1，诱导前胱天蛋白酶1进行自我剪切生成活化的胱天蛋白酶1，通过对相应炎性因子的剪切激活，最终引发炎症反应[5]。

1.2NLRP3炎症小体的活化过程 目前对NLRP3炎症小体激活的具体机制尚不清楚，但已知的激活模式主要有：①半通道模式，胞外的腺苷三磷酸能够与细胞膜上P2X7嘌呤受体结合开通离子通道，大量K+外流，同时促进半通道蛋白Pannexin-1通道形成，使细胞外NLRP3配体进入细胞内，直接促进NLRP3炎症小体的聚集和活化。②溶酶体破坏模式，一些晶体物质(如石英、二氧化硅、单钠尿酸盐等)被吞噬细胞吞噬后，将溶酶体破坏，使溶酶体中一系列蛋白酶释放到胞质中，直接激活NLRP3炎症小体。③活性氧类(reactive oxygen species，ROS)模式，细胞接受刺激时，氧化酶组装活化，线粒体合成ROS，产生的ROS可以作为信号激活NLRP3炎症小体。④其他模式，细胞外葡萄糖、细菌RNA、线粒体DNA等均可激活NLRP3炎症小体[6-7]。

2 NLRP3炎症小体与腹膜透析相关腹膜纤维化

2.1NLRP3炎症小体与细菌感染所致腹膜炎 细菌感染所致腹膜炎是腹膜透析的常见并发症，其反复发生会严重影响腹膜超滤功能和透析效能，最终使患者退出腹膜透析。腹膜透析患者发生急性细菌性腹膜炎可激活NLRP3炎症小体，促进其下游多种促炎介质(如IL-1β、IL-18等)的合成和分泌，与腹膜结构和功能密切相关。Hautem等[8]在发生急性细菌性腹膜炎的腹膜透析患者和用脂多糖诱导的腹膜炎大鼠模型腹膜组织研究中发现，NLRP3和IL-1β的信使RNA表达均明显增加，同时腹水中IL-1β表达亦明显升高，且NLRP3和IL-1β激活程度与透析液中中性粒细胞增加的比例呈正相关。若敲除NLRP3基因，IL-β表达受到抑制，同时，在急性腹膜炎时发生的溶质转运障碍又得到恢复，可见，腹膜透析患者发生急性细菌性腹膜炎时可激活NLRP3炎症小体，并促进下游多种促炎介质(如IL-1β、IL-18 等)的合成和分泌。一项纳入210例感染性腹膜炎腹膜透析患者的研究显示，腹水中炎性因子IL-1β、IL-6和转化生长因子β均明显升高[9]。IL-1β是NLRP3炎症小体下游重要的促炎因子，过度和(或)持续激活可造成广泛组织损伤。将腺病毒转载IL-1β至尿毒症大鼠腹膜组织可引起炎性细胞浸润，随即发生严重的急性腹膜炎，即使腹膜炎症状缓解，促炎因子仍释放达数周，并可潜在影响腹膜形态和功能[10]。有研究发现，腹膜透析患者中IL-1β的基因多态性与腹膜炎相关，C等位基因携带者与腹膜炎的风险增加有关[11]。同时，IL-1β有望作为鉴别各种类型腹膜炎的生物标志物，有助于选择适当的抗生素治疗[12]。

2.2NLRP3炎症小体与慢性非细菌性腹膜炎 残余肾功能下降、尿毒症毒素、透析所致暴露增加、高糖和低pH溶液反复刺激等原因可引起腹膜透析患者腹膜慢性非细菌性炎症反应，促使腹膜间皮细胞转分化亦是腹膜纤维化的重要环节之一[13]。长期行腹膜透析患者非细菌性炎症发生率高，且与腹膜纤维化的发展速度呈正相关[14-15]。有研究发现，NLRP3炎症小体可介导高浓度葡萄糖透析液诱导的腹膜慢性非细菌炎症反应，高糖刺激腹膜间皮细胞后，IL-1β和IL-18表达明显升高，且呈时间和剂量依赖性，用干扰小RNA下调腹膜间皮细胞NLRP3的表达时，由高糖刺激产生的IL-1β明显减少。IL-1β和IL-18是重要的促炎因子，可导致下游IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子α等炎性因子的表达增加，这些炎性因子相互作用形成复杂的网络结构共同参与炎症反应，最终导致腹膜结构和功能变化[16-17]。Chin等[18]发现，慢性肾脏病状态下机体代谢废物(如尿毒症毒素)可活化NLRP3炎症小体。晚期肾衰竭患者和透析患者(包括血液透析和腹膜透析)血清中促炎细胞因子IL-1β、肿瘤坏死因子α和IL-6表达均明显升高，且与肾小球滤过率呈负相关[19]。由此推测，当腹膜长期直接暴露于异常代谢环境，细胞内稳态发生改变，继而可产生多种危险信号分子(如ROS、腺苷三磷酸等)。危险信号分子被细胞内模式识别受体识别后可激活NLRP3炎症小体，通过效应分子胱天蛋白酶1、IL-1β和IL-18等作用于腹膜间皮细胞，使其发生细胞凋亡或上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，从而导致腹膜纤维化。

2.3NLRP3炎症小体与腹膜纤维化 腹膜结构和功能的改变是影响腹膜透析治疗的关键因素，长期腹膜透析患者的腹膜组织中可观察到间皮下层的厚度逐渐增加，并伴随腹膜纤维化形成，这些慢性改变在患者发生严重或反复发生腹膜炎时更加明显[20]。一项对212例腹膜透析患者进行的腹膜组织检查发现，正常人不存在腹膜纤维化，腹膜透析患者活检组织中腹膜纤维化的发生率高达56%[21]。反复发生的急慢性腹膜炎是导致腹膜间皮细胞发生EMT的主要原因，而EMT是腹膜透析相关腹膜纤维化的重要机制，最终导致超滤衰竭使患者透析终止[22]。

体外研究发现，IL-1β可呈剂量依赖性地诱导肾小管及肿瘤细胞等发生EMT，并参与肿瘤细胞的远处转移[23-24]。高糖腹膜透析液可活化腹膜间皮细胞的NLRP3，呈时间和剂量依赖性，并诱导腹膜间皮细胞发生EMT，将NLRP3干扰小RNA转染至间皮细胞，沉默NLRP3的表达，结果发现，可部分抑制含糖腹膜透析液诱导的腹膜EMT[25]。IL-1β刺激间皮细胞时，纤维化指标纤维连接蛋白表达增加，并发生可逆性的EMT，转分化的间皮细胞中上皮钙黏素的分泌减少，伴细胞外基质、波形蛋白和平滑肌肌动蛋白成分等增加[26]。综上所述，NLRP3炎症小体活化可介导高糖腹膜透析液诱导的腹膜间皮细胞转分化。

用腺病毒转载IL-1β至尿毒症大鼠腹膜组织后可引起急性腹膜炎症，腹膜组织中转化生长因子β和纤维连接蛋白的信使RNA表达明显增加，胶原沉积，并出现间皮下纤维组织变厚、腹膜纤维化，进而导致腹膜超滤功能下降，但腹膜炎症状在1周左右可缓解，由于纤维连接蛋白信使RNA的表达在21 d后仍有持续升高趋势，故腹膜纤维化可持续至21 d甚至更长时间[10]。大鼠实验中用丙戊酸作用转化生长因子β/Smad通路抑制腹膜纤维的同时，炎性因子IL-1β的表达明显降低[27]。综上所述，NLRP3/IL-1β参与并调控腹膜透析相关腹膜炎以及腹膜纤维化的发生、发展过程，具体作用机制尚不明确，但临床上当患者经历一次或数次腹膜炎后，腹膜纤维化的程度会明显增加，而IL-1β可能起重要作用。干预NLRP3炎症小体的活化可能对延缓腹膜纤维化有重要意义。

3 NLRP3炎症小体与线粒体损伤

NLRP3炎症小体是沟通腹膜透析相关腹膜炎症和腹膜纤维化的桥梁，但其具体调节机制尚不明确。研究发现，NLRP3炎症小体活化与线粒体的损伤、代谢和自噬密切相关[28-29]。线粒体是真核细胞内的能量转换细胞器，除提供细胞生命活动所需能量外，还参与调控细胞内环境钙离子浓度的稳定、凋亡、细胞信号转导和衰老等功能[30]。目前，越来越多的研究证明，NLRP3炎症小体参与腹膜透析相关腹膜纤维化的过程可能受到线粒体的调控[31-33]。阐明NLRP3炎症小体和线粒体的关系可为延缓腹膜纤维化提供新思路。

3.1NLRP3炎症小体和ROS 线粒体发生功能障碍时，ROS的产生超过机体清除能力，过量ROS激活相关信号通路引起细胞损伤。近年来，线粒体来源的ROS被认为是NLRP3炎症小体的调控中心[34]。研究表明，线粒体靶向抗氧化剂阻断ROS的产生可抑制肾小管上皮细胞NLRP3炎症小体的激活以及细胞损伤[35]。高糖培养腹膜间皮细胞时，ROS产生增加，与时间和剂量呈正相关，而过量的ROS使NLRP3炎症小体激活，导致IL-1β的分泌[36]。ROS是瞬态分子，只在短距离内充当信号信使，因此被定位在靠近线粒体的有效NLRP3才能对该细胞器产生的ROS进行有效的信号转导。在慢性肾脏病血液透析患者外周血单个核细胞的线粒体中发现，NLRP3与凋亡相关斑点样蛋白、线粒体共区域化，而正常人群外周血单核细胞中，NLRP3残留在细胞质颗粒结构中[37]。进一步证实了线粒体来源的ROS可激活NLRP3炎症小体。有研究用高糖以及线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ抑制剂鱼藤酮、线粒体呼吸链酶复合体Ⅱ抑制剂TTFA、线粒体呼吸链酶复合体Ⅲ抑制剂抗霉素A分别处理人腹膜间皮细胞诱导线粒体功能障碍发现，高糖、鱼藤酮和剂抗霉素A可使线粒体ROS产生增加，IL-1β表达上调，而TTFA对ROS和IL-1β表达无明显影响，表明应用高糖腹膜透析液或线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ和线粒体呼吸链酶复合体Ⅲ抑制剂会导致ROS升高和IL-1β高表达[37]。NLRP3炎症小体是调控IL-1β表达的关键分子，应用微RNA技术下调NLRP3的表达后，由高糖透析液和线粒体呼吸链抑制剂作用于腹膜间皮细胞产生的IL-1β表达均明显减弱，表明高糖腹膜透液可损伤腹膜间皮细胞线粒体功能，产生更多的ROS并激活NLRP3炎症小体，其机制可能与线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ和线粒体呼吸链酶复合体Ⅲ活性增强有关，并在肾小球系膜细胞中也得到了类似的结果[37-38]。

3.2NLRP3炎症小体活化与线粒体DNA 线粒体DNA是线粒体内的遗传物质，线粒体功能障碍时，从线粒体释放至胞质，成为损伤相关分子模式[38]。有研究发现，巨噬细胞线粒体功能障碍时释放至胞质的线粒体DNA可直接结合并活化NLRP3炎症小体，介导下游炎性因子IL-1β等的合成和分泌，参与炎症反应和组织损伤[29,39]。将腹膜间皮细胞暴露在高糖透析液中，可观察到线粒体膜电位的消散，并伴随细胞色素C、ROS和线粒体DNA的产生以及释放的明显增加[40]。有研究表明，循环线粒体DNA水平与慢性肾脏病患者全身炎症状态显著相关，并发现慢性肾脏病患者尿液中线粒体DNA浓度明显升高，与肾小球滤过率呈负相关，有可能作为半段是否需要透析治疗的指标之一[41]。一项纳入197例腹透患者的研究发现，循环线粒体DNA水平明显升高，与血清C反应蛋白水平呈正相关[42]。综上所述，线粒体DNA可能参与腹膜透析患者的炎症反应，但是否通过调控NLRP3炎症小体仍不明确，需要体内外实验的进一步探究。

3.3NLRP3炎症小体活化与自噬 线粒体是一种易损伤的细胞器，及时清除细胞内受损线粒体对维持细胞正常生理状态具有重要作用。细胞内功能受损的线粒体主要通过自噬进行清除[43]。有研究报道，敲除自噬基因ATG16L1或ATG7的巨噬细胞中，IL-1β表达量增多，而IL-1β的成熟与释放依赖于NLRP3炎症小体活化，表明自噬可能调节NLRP3炎症小体的活性[44]。在体外培养的腹膜间皮细胞中加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干扰自噬形成的关键蛋白(Beclin1干扰小RNA、ATG5干扰小RNA)作为自噬阻断剂后发现，受损线粒体增多，线粒体释放的ROS增多，IL-1β表达量亦明显增强，而用白藜芦醇诱导细胞自噬后，NLRP3炎症小体激活上调IL-1β表达的效应却明显减弱[34]。可见，抑制自噬过程可使功能障碍的线粒体在胞内堆积并产生大量ROS激活NLRP3炎症小体，而适度自噬可维持线粒体功能，并可抑制NLRP3炎症小体的激活。此外，NLRP3炎症小体激活后亦可抑制自噬，影响线粒体的自我清除，对动脉粥样硬化等疾病的发展起促进作用[45]。由此推测，行腹膜透析时，腹膜间皮细胞受到炎症、高糖、低pH腹膜透析液刺激，细胞线粒体损伤，ROS和线粒体DNA等产生明显增加，激活NLRP3炎症小体及其下游炎性因子参与腹膜透析相关腹膜炎症及腹膜纤维化，而线粒体自噬又可抑制以上过程的持续激活。

4 小 结

腹膜透析受到各种感染及非生物相容性腹膜透析液等的反复刺激，可导致NLRP3炎症小体的激活，并通过活化的半胱氨酸蛋白酶1持续地将前IL-1β和前IL-18剪切为成熟的IL-1β和IL-18，进而激活其下游信号转导通路产生大量炎性介质，引起机体炎症反应和腹膜纤维化。NLRP3炎症小体在腹膜透析相关腹膜炎症和腹膜纤维化的重要性受到越来越多的关注。目前，以NLRP3炎症小体为靶点的药物也正在做有益的尝试，但具体调控机制仍不明确。腹膜透析时，线粒体损伤在NLRP3炎症小体的激活过程中起重要作用，线粒体损伤有关的ROS、线粒体DNA以及自噬均与各组织器官的纤维化密切相关，其在腹膜纤维化的重要性也日益受到关注。可见，用保护线粒体功能的方法抑制NLRP3炎症小体激活可能为探索延缓腹膜纤维化提供新思路。