肺结核患者血液和痰液中特异性CD4+T淋巴细胞CD27表达水平及其诊断新发肺结核的价值 ▲

方志雄 徐 磊 张海明 林 沙

(湖南省湘潭市中心医院感染科，湘潭市 411100，电子邮箱：fzx8214907@163.com)

肺结核是由结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)引起的传染性疾病，在全世界范围内均具有较高的发病率，根据世界卫生组织的报告，2015年全球结核病患病人数已超过800万，其中近100万患者因肺结核死亡[1]。目前诊断肺结核的主要手段为细菌学检测，但常规痰涂片的敏感性较低，而痰培养的周期长达1～2个月，时效性不佳[2]。流行病学研究表明，只有5%～10%感染MTB的患者最终会发展为活动性结核[3]，这表明人体免疫系统具有较强的保护力，能够有效地抑制体内MTB的繁殖以防止发展成活动性疾病。CD4+T淋巴细胞是T淋巴细胞中的重要亚群，在细胞免疫中发挥了重要作用，其状态与结核活动密切相关。而CD27是肿瘤坏死因子受体家族的成员，在细胞免疫中具有重要作用[4]。目前，关于结核病患者血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平的研究较少，且其对新发结核病的诊断价值仍未明确。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年6月至2017年6月间在我院确诊的33例新发肺结核Ⅰ型进展期患者为新发组。纳入标准：(1)结合临床表现、影像学表现，经痰涂片或痰培养确诊为肺结核的新发患者；(2)未经抗结核药物治疗；(3)不存在免疫系统疾病和血液系统疾病；(4)近3个月未服用增强或抑制免疫的药物。排除标准：(1)先天性或获得性免疫功能异常患者；(2)合并其他肺部感染患者；(3)存在恶性肿瘤和严重肝肾功能障碍患者。选择同期经抗结核药物治疗后细菌检测结果为阴性的33例肺结核患者为经治组。纳入标准：(1)既往临床表现、影像学表现符合肺结核，并经痰涂片或痰培养确诊为肺结核，并经抗结核药物治疗后痊愈(痊愈定义为痰涂片阳性肺结核患者完成规定疗程，连续2次痰涂片结果阴性，其中1次是治疗末[5])；(2)痰培养结核杆菌阴性；(3)近3个月未服用增强或抑制免疫的药物。排除标准同新发组。另选择同时期、同年龄段的33例健康者作为对照组。3组患者的年龄、性别、体质指数及外周血白细胞计数、淋巴细胞百分比比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 3组患者的一般资料

1.2 研究方法

1.2.1 主要试剂与仪器：淋巴细胞提取液(美国GE医疗，批号：150311)，改良RPMI-1640培养基(美国Sigma，批号：160243)，藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的鼠抗人CD4、CD154和CD27抗体(英国Biorbyt公司，批号：141209、141104、150104)；皮内注射用卡介苗(陕西医药控股，国药准字：S10960096；0.25 mg/支；批号：150903)。CytomicsTMFC 500全自动五色数字化流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；7E-A/B吸痰器(鱼跃医疗)。

1.2.2 血标本处理：抽取所有研究对象静脉血2 mL至乙二胺四乙酸抗凝管中，混匀后，将1.5 mL血标本加到15 mL淋巴细胞提取液表面，以2 000 r/min离心20 min，随后分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，依照淋巴细胞提取液说明书进行分离。

1.2.3 痰液标本处理：诱导排痰参照文献[6]进行，取2 mL痰液经吸痰器过滤器滤过后置于4℃保存。1.5 mL痰液加到15 mL淋巴细胞提取液表面，以2 000 r/min离心20 min，随后分离PBMC，依照淋巴细胞提取液说明书进行分离。

1.2.4 抗原刺激与荧光染色：将从血液和痰液中分离的PBMC分别加入96孔平底带盖无菌培养板中，每孔100 μL；之后每孔依次加入10 μL的10 μg/L卡介苗和10 μL PE标记的CD154抗体(滴度1 ∶64)，37℃培养16～20 h后分别加入CD4和CD27 PE荧光抗体染色剂(美国Sigma公司，批号：151270)10 μL进行染色；再次培养16～20 h后使用磷酸缓冲盐溶液各进行1次洗涤和重悬；重悬后每孔加入3 μL抗体浓度为25 mg/mL PE标记CD4抗体和8 μL抗体浓度为25 mg/mL PE标记CD27抗体，避光染色30 min后，加入300 μL固定/破膜剂(美国Sigma公司，批号：160183)，振荡均匀，室温放置20 min；以1 200 r/min离心5 min去除上清液，加入检测细胞内细胞因子用的5 μL荧光素标记抗体(美国Sigma公司，批号：160836)，混合均匀，室温避光孵育20 min；用1 mL磷酸缓冲盐溶液重悬洗涤细胞，以1 200 r/min离心5 min去除上清液。磷酸缓冲盐溶液各进行1次洗涤和重悬，将样本置于4℃避光条件下保存待检。

1.2.5 CD27表达检测：按照流式细胞仪操作手册进样后使用配套CXP软件进行分析。从选取的淋巴细胞中以 CD4-PE-Cy5、CD154-PE设立横纵坐标，建立二维点图，通过CD4+CD154+T淋巴细胞门圈出CD4+T淋巴细胞(见图1A)；从选取的CD4+T淋巴细胞中以CD27-PE-Cy7门圈出CD27+的CD4+T淋巴细胞亚群(见图1B)。样本细胞数均≥105个。

图1 CD4+T淋巴细胞及表达CD27+CD4+T淋巴细胞的典型流式细胞分析图像

1.3 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。服从正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t法；不服从正态分布的计量资料采用M(P25，P75)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Mann-Whitney检验。计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线及曲线下面积(area under the curve，AUC)评价血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平诊断新发肺结核的效能。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平 3组血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平比较，差异有统计学意义(均P<0.05)；其中，新发组血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平高于经治组和对照组，而经治组血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平低于对照组(均P<0.05)。见表2。

表23组血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平[M(P25，P75)，%]

组别n血液痰液新发组3376.61(71.39,85.80)ab80.32(76.07,88.61)ab经治组3333.15(24,46.02)a40.12(28.25,48.90)a对照组3360.14(54.45,68.54)56.17(46.66,66.15)H值63.16166.592P值<0.001<0.001

注：a与对照组比较，P<0.05；b与经治组比较，P<0.05。

2.2 血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平诊断新发肺结核的效能 以是否诊断为新发肺结核为状态变量(新发患者为阳性，经治患者和对照人群为阴性)，以血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平为自变量进行ROC曲线分析。结果显示，血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平诊断新发肺结核的AUC分别为0.883和0.912，两者比较差异无统计学意义(z=0.725，P=0.468)。见表3和图2。

表3 血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平诊断新发肺结核的ROC曲线分析结果

图2 血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平诊断新发肺结核的ROC曲线

3 讨 论

目前，结核的诊断和治疗技术已取得了巨大进步，但肺结核的疫情并未得到显著控制[7]。随着我国城市化进程的加快和人口流动性的增加，肺结核的诊断、治疗和管理的困难增大[8]。控制结核的传播依赖于有效的诊断与监测方法，而常用的微生物学检查、结核菌素试验和胸部影像学检查均有较大的局限性。MTB的感染和活动与T淋巴细胞的功能状态高度相关，而基于T淋巴细胞分析的免疫学检测用于结核的诊断和监测具有很高的潜力。相关研究显示，γ干扰素释放试验已用于检测MTB感染[9]，表现出了较高的敏感性[10]，但对于活动性结核、潜伏性结核和经治结核的诊断能力较差[11]。CD27是一种跨膜糖蛋白，也是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，主要分布于活化的T淋巴细胞表面，被认为是T淋巴细胞激活和炎症反应的一种标志物[12]。研究显示，CD27是记忆T淋巴细胞形成的必需组分，CD27通过与CD70结合，可以诱导核因子κB通路的激活，并极大地增强体内T淋巴细胞应答[13]，而敲除CD27的小鼠的记忆T淋巴细胞对刺激二次应答明显降低[14]。动物模型研究显示，与野生型小鼠相比，敲除CD27基因的小鼠感染病毒和MTB时，效应T淋巴细胞的数量减少，其中CD4+T淋巴细胞减少最为明显[15]，这提示CD4+T淋巴细胞CD27的表达水平或许可用于结核病的诊断。

结核患者的免疫系统功能明显异常，其中T淋巴细胞的亚群构成改变更为显著，多项基于中国人群或欧美人群的免疫学研究结果均显示，结核患者CD4+T淋巴细胞的比例和功能状态均明显降低[16-18]。卡介苗是临床常用的结核疫苗，在结核病的免疫研究中也有重要作用，经卡介苗刺激后产生的T淋巴细胞具有高度的结核相关特异性，可以反映机体对于MTB的免疫状态[19]。因此，本研究采用卡介苗对血液及痰液标本进行抗原刺激后，分析新发肺结核患者、经治肺结核患者以及健康对照人群血液和痰液中特异性CD4+T淋巴细胞CD27表达水平。结果显示，新发肺结核患者血液和痰液中特异性CD4+T淋巴细胞CD27表达水平高于经治组和对照组(均P<0.05)。这提示血液和痰液中特异性CD4+T淋巴细胞CD27表达水平可能与结核感染状态相关，与Nikitina等[20]的研究结果相似。ROC曲线分析结果显示，应用血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平诊断新发肺结核的价值均较高，但两者的AUC差异无统计学意义(P>0.05)。Petruccioli等[21]的研究结果显示，血液特异性CD4+T淋巴细胞CD27表达水平对结核患者特别是潜伏性结核患者，具有较好的诊断价值；Schuetz等[22]在针对合并HIV感染的结核患者的研究中也得出了类似结论；Portevin等[23]的研究结果显示，基于T淋巴细胞CD27表达水平的TAM-TB检验用于诊断儿童结核病具有良好的敏感性和特异性。以上结果均提示将CD4+T淋巴细胞CD27表达水平应用于诊断结核病具有较大潜力。

综上所述，肺结核患者血液和痰液中特异性CD4+T淋巴细胞CD27表达水平明显降低，而新发结核患者更为明显；血液和痰液中CD4+T淋巴细胞CD27表达水平对新发肺结核的诊断效能均较好。但本研究为单中心小样本的观察性研究，受限于纳入人群范围和样本量，相应的诊断截点值用于其他人群的效果尚需下一步多中心大样本研究进一步明确。