槲皮素对脂多糖诱导人肝细胞炎性损伤的改善作用及其机制

(武汉大学人民医院1 感染管理办公室，2 药学部，湖北省武汉市 430060，电子邮箱：zhangwhu@hotmail.com)

炎症损伤被认为是细胞发生损伤的重要诱导因素，当细胞处于炎性因子高表达的环境时，会引起细胞膜受体的激活，从而将胞外信号传导至胞内以激活炎性或其他损伤信号通路，导致细胞处于炎性损伤状态，进一步改变细胞结构的完整性，诱发细胞凋亡或死亡，导致诸如氧化应激、精神病症及肿瘤等疾病的发生发展[1-2]。槲皮素主要存在于中草药及蔬果中，属于天然黄酮类活性物质，在抗炎、抗氧化、抗癌等方面效果显著[3]；并且其可减轻肝炎、肝硬化所致的肝损伤，还通过诱导P21WAF1/CIP1表达促进肝癌细胞的凋亡[4-5]。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)作为硫氧还蛋白的内源性抑制剂，是细胞重要的抗氧化还原蛋白和抗凋亡蛋白[6]。TXNIP被激活后可以诱导NACHT-LRR-PYD结构域蛋白3(NACHT,LRR and PYD domains-containing protein 3，NLRP3)炎性通路活化[7]。有研究表明非酒精性脂肪性肝病患者血清中TXNIP水平显著高于正常人群，并且其水平与炎症及胰岛素抵抗密切相关[8]。本研究探讨槲皮素对脂多糖诱导人肝细胞L02炎性损伤的改善作用，以及其对TXNIP/NLRP3炎症通路的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人肝细胞(L02)购买于武汉巴菲尔生物有限公司(从美国ATCC细胞库引进)。

1.2 药品与试剂 脂多糖(Sigma公司，批号：L2880)；槲皮素(Sigma公司，CAS编号：117-39-5；≥99%)，杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；上海吉诺公司，批号：30600034)；胎牛血清(Gibco公司，批号：110419)；胰酶(Gibco公司，批号：1220087)；细胞计数检测(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒(日本同仁研究所，批号：WST-8)；白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immumosorbent assay，ELISA)试剂盒(武汉华美生物有限公司，批号：SV30087)；RIPA裂解液(上海吉诺公司，批号：C1325)；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒(上海谷歌生物有限公司，批号：131221)；二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒(上海谷歌生物有限公司，批号P0010S-01)；牛血清白蛋白粉末(武汉谷歌生物有限公司，批号：HB10038)；β肌动蛋白(β-actin，批号：ab1006325)、诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS，批号：ab1552141)、环氧化酶(cyclooxygenase，COX-2，批号：ab2300142)、TXNIP(批号：ab3265217)及NLRP3(批号：ab1230014)一抗(Abcam公司)及二抗羊抗兔IgG(武汉谷歌生物有限公司，批号：SYT30024)。

1.3 仪器 BBS-V8800型单人超净台(AIRTECH公司)；CB15C02型细胞培养箱(德国Binder公司)；Victor3 1420 Multilabel Counter型酶标仪(美国Perkin Elmer公司)；DYCZ-24DN型SDS-PAGE凝胶电泳仪(北京六一仪器厂)；Odyssey型双色红外激光成像系统(LI-COR公司)。

1.4 L02细胞培养 L02细胞复苏后，接种于含10%胎牛血清、1% A-A(100 U/ml青霉素-100 U/ml链霉素)DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2、90%的饱和湿度恒温培养箱中培养。待细胞长到80%～90%时，用0.25%胰酶-0.125%乙二胺四乙酸消化，待细胞变圆加入新培养基终止消化，并以1 ∶3比例传代。

1.5 药物毒性试验 将L02细胞用NMEM完全培养液重悬后，以1×104个细胞/孔接种于96孔板，待细胞贴壁生长到50%～60%时，取出培养板，弃去旧培养基，分别加入含不同浓度槲皮素的(0、50、100、200、400、800、1600 μmol/L)稀释培养液，继续置于37℃、5% CO2、90%的饱和湿度培养箱中培养。24 h后加入CCK-8试剂，轻轻震荡均匀后于培养箱中继续孵育1 h，取出置于酶标仪上，于450 nm处测定吸光度(A)值，计算细胞相对存活率，相对存活率=A实验组/A对照组。每个浓度设6个复孔。

1.6 槲皮素对脂多糖干预后L02细胞增殖的影响 按“1.5”的方法接种细胞后，将细胞分为正常对照组、脂多糖诱导组、脂多糖+低剂量(50 μmol/L)槲皮素组、脂多糖+中剂量(100 μmol/L)槲皮素组、脂多糖+高剂量(200 μmol/L)槲皮素组。各浓度槲皮素组中加入相应浓度槲皮素溶液，2 h后除正常对照组外均加入200 μl脂多糖溶液(0.1 μg/ml)。培养24 h，吸去旧培养液，每孔加入10 μl CCK-8试剂，孵育1 h后于酶标仪450 nm波长下测定A值。每组平行试验设置4个复孔。计算细胞相对存活率。

1.7 槲皮素对脂多糖干预后L02细胞上清炎性因子水平的影响 将L02细胞用NMEM完全培养液重悬后，以1×105个细胞/孔接种于6孔板，待细胞贴壁生长到50%～60%后，取出培养板，弃去旧培养基，按“1.6”的方法进行分组及药物处理后，继续置于37℃、5% CO2、90%的饱和湿度培养箱中培养，24 h后，收集细胞及上清，4℃下12 000 r/min离心5 min。检测上清液的炎性因子IL-1β及TNF-α水平，其操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.8 槲皮素对脂多糖干预后L02细胞相关蛋白表达的影响 将“1.7”中获得的细胞用RIPA裂解液充分裂解，采用二喹啉甲酸试剂盒检测蛋白浓度。向蛋白裂解液中加入蛋白上样缓冲液，于100℃加热煮沸7 min。每孔加入50 μg蛋白上样，在10%的SDS-PAGE凝胶中电泳分离蛋白，分离胶电泳时电压设置为70 V，浓缩胶电泳分离时电压设置为120 V；蛋白分离完成后在270 mV电流转膜90 min；5%脱脂牛奶封闭1 h；分别以β-actin、iNOS、COX-2、TXNIP及NLRP3一抗(稀释比1 ∶1 000)孵育(4℃)过夜后，用TBST洗膜3次，10 min/次，再二抗(稀释比1 ∶3 000)室温孵育1 h，用TBST洗膜3次，10 min/次，用双色红外激光成像系统扫膜分析蛋白表达水平。其中以β-actin为内参。

1.9 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 槲皮素对L02细胞的药物毒性作用 不同浓度槲皮素干预后L02细胞组间的相对存活率差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同浓度槲皮素干预后L02细胞的相对存活率(x±s，%)

2.2 槲皮素对脂多糖干预后L02细胞增殖的影响 与正常对照组相比，其他4组L02细胞相对存活率均降低(均P<0.05)；脂多糖诱导组、脂多糖+低剂量槲皮素组、脂多糖+中剂量槲皮素组、脂多糖+高剂量槲皮素组的细胞相对存活率依次升高(均P<0.05)。见表2。

表2 5组L02细胞的相对存活率(x±s，%)

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与脂多糖诱导组比较，#P<0.05；与脂多糖+低剂量槲皮素组比较，●P<0.05；与脂多糖+中剂量槲皮素组比较，▲P<0.05。

2.3 槲皮素对脂多糖干预后L02细胞上清炎性因子水平的影响 脂多糖诱导组L02细胞上清IL-6、IL-1β及TNF-α水平均高于正常对照组(均P<0.05)；不同剂量槲皮素干预组细胞上清IL-6、IL-1β及TNF-α水平均低于脂多糖诱导组(均P<0.05)。见表3。

表3 5组L02细胞上清炎性因子水平比较(x±s，pg/ml)

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与脂多糖诱导组比较，#P<0.05。

2.4 槲皮素对脂多糖干预后L02细胞iNOS及COX-2蛋白表达水平的影响 脂多糖诱导组细胞iNOS及COX-2蛋白的相对表达水平均高于正常对照组(均P<0.05)；不同剂量槲皮素干预组细胞iNOS及COX-2蛋白的相对表达水平均低于脂多糖诱导组(均P<0.05)。见表4及图1。

表4 5组L02细胞相关蛋白相对表达水平比较(x±s)

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与脂多糖诱导组比较，#P<0.05。

图1 5组细胞炎性蛋白表达情况

注：1、2、3、4、5分别为正常对照组、脂多糖诱导组、脂多糖+低剂量槲皮素组、脂多糖+中剂量槲皮素组、脂多糖+高剂量槲皮素组。

2.5 槲皮素对脂多糖干预后L02细胞TXNIP及NLRP3蛋白表达水平的影响 脂多糖诱导组细胞TXNIP、NLRP3蛋白的相对表达水平均高于正常对照组(均P<0.05)；不同剂量槲皮素干预组细胞TXNIP、NLRP3蛋白相对达水平均低于脂多糖诱导组(均P<0.05)。见表4及图2。

图2 5组细胞TXNIP及NLRP3蛋白表达情况

注：1、2、3、4、5分别为正常对照组、脂多糖诱导组、脂多糖+低剂量槲皮素组、脂多糖+中剂量槲皮素组、脂多糖+高剂量槲皮素组。

3 讨 论

随着社会经济水平的提高，人类饮食结构及生活方式的改变，非酒精性脂肪肝的患病率越来越高，并且发病呈年轻化趋势。如果得不到有效的治疗，部分患者可发展为肝硬化甚至肝癌，其已经成为一种严重威胁人类生命健康的疾病[9]。TXNIP又称为维生素D3上调蛋白，属于视紫红质抑制蛋白家族成员，广泛参与肿瘤、免疫及炎症反应。近期研究表明TXNIP可以与硫氧还蛋白结合相互作用引发氧化应激，而且其高表达水平还会诱导炎性通路的激活[10]，且与肝脏疾病的发生发展密切相关[11-12]。槲皮素属于一种药理活性较强的天然成分，在多种病理反应中均具有较好的抑制作用。槲皮黄酮不仅对多种致癌剂、促癌剂有拮抗作用，而且可以抑制多种恶性肿瘤细胞的生长；并且槲皮素对人卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞等生长均有较好的抑制作用[13]。本课题组的早期研究结果也表明槲皮素能够减轻酒精性肝损伤大鼠肝脏组织的炎性及坏死，其主要通过降低内毒素水平、抑制库普弗细胞活化和下调促炎细胞因子表达实现[14]，并可降低高同型半胱氨酸水平及氧化应激[15]；此外槲皮素能通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路改善肝纤维化[16]。

本研究采用脂多糖体外诱导建立L02细胞炎性损伤模型，结果显示脂多糖诱导组的L02细胞相对存活率低于正常对照组(均P<0.05)，且炎症因子(IL-6、IL-1β 及TNF-α)、炎性蛋白(iNOS、COX-2)及炎性通路相关蛋白(TXNIP及NLRP3)水平均高于正常对照组(均P<0.05)，即脂多糖可抑制L02细胞的增殖，刺激炎性因子及炎性蛋白的高表达，高度活化炎性信号通路，提示L02细胞炎性损伤模型构建成功。采用槲皮素干预L02细胞后发现，不同浓度槲皮素干预组间L02细胞的相对存活率差异无统计学意义(P>0.05)，提示槲皮素对L02细胞没有毒性作用。我们进一步观察槲皮素对脂多糖干预后L02细胞增殖、炎症因子及相关蛋白表达情况的影响，结果显示，脂多糖诱导组、脂多糖+低剂量槲皮素组、脂多糖+中剂量槲皮素组、脂多糖+高剂量槲皮素组的细胞相对存活率依次升高(均P<0.05)，提示槲皮素可改善脂多糖所致的细胞损伤，且呈浓度依赖性。此外，不同剂量槲皮素干预组IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS、COX-2、TXNIP及NLRP3水平均低于脂多糖诱导组(均P<0.05)，这提示槲皮素可以抑制L02细胞中炎性因子及蛋白的表达，并抑制TXNIP/NLRP3炎性信号通路的活化。

综上所述，槲皮素可以改善脂多糖诱导的L02细胞的炎性损伤，其可能通过降低TXNIP/NLRP3通路的活性发挥作用。