NOD样受体蛋白3、Toll样受体2在胎膜早破患者胎盘和胎膜组织中的表达及其临床意义▲

(1 江苏省如皋市人民医院检验科，如皋市 226500，电子邮箱：cuoasoa@163.com；2 南通大学附属海安医院妇产科，江苏省海安市 226600)

胎膜早破(premature rupture of membrane，PROM)是产科常见疾病，是指在临产期孕产妇出现的胎膜破裂，屏障能力的消失导致胎盘早剥、感染、绒毛膜羊膜炎、早产、新生儿呼吸窘迫综合征等母婴并发症，对母婴安全和健康产生严重威胁[1]。PROM发生的最基本病理变化是胎膜结构缺陷和炎症，研究指出，在众多影响PROM发生的因素中，细菌、衣原体、支原体等感染不仅是导致生殖道炎症的常见因素，同时也被公认为与PROM密切相关[2]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor,NLR)是一类参与人体先天性免疫应答的具有可识别体内和侵入人体危险信号作用的位于细胞内的模式识别受体。NOD样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein-3,NLRP3)属于NLRP家族，其被认为参与了感染性疾病、自身免疫性疾病等非特异性免疫应答过程[3]。有学者发现，受到细菌感染的离体胎膜组织中可见NLRP3表达升高，其可介导胎盘、胎膜、羊水、脐血等妊娠组织释放炎性因子[4]。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是一类参与体内固有免疫的蛋白质家族，作为对相关分泌炎性介质产生激活作用的闸门受体，其主要在细胞信号传导通路中发挥作用，其中以TLR-2最为常见，其能识别多种病原微生物和产物，在PROM的发生中具有关键作用[5]。本研究探讨NLRP3、TLR-2在PROM组织中的表达及其临床意义，为防治PROM提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年4月至2017年11月我院收治的90例PROM患者作为观察组，根据孕周分为观察1组[孕周≥37周，足月胎膜早破(term premature rupture of membranes，TPROM)组48例]和观察2组[孕周28～36+6周，未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membranes，PPROM)组42例]；另选取同期在我院分娩的健康孕妇70例作为对照组，根据孕周不同分为对照1组(孕周≥37周，足月对照组)和对照2组(孕周28～36+6周，未足月对照组)，各35例。观察组患者根据《妇产科学》(第7版)中PROM的诊断标准确诊[6]，均存在生殖道感染，PROM前14 d内羊水培养或阴道分泌物培养呈阳性。排除母体有产科并发症、妊娠疾病，胎儿胎位异常等病例。对照组孕妇均无宫内感染，无妊娠并发症，其中对照2组为宫颈机能不全而终止妊娠的产妇。入选者均为单胎妊娠。观察1组年龄23～34(27.24±3.96)岁；孕周(39.13±1.01)周；体质指数(body mass index,BMI)为(29.14±3.76)kg/m2。观察2组年龄23～35(27.71±3.82)岁；孕周(35.01±1.42)周；BMI(29.43±3.65)kg/m2。对照1组年龄23～34(28.01±3.86)岁；孕周(39.71±1.10)周；BMI(29.51±3.81)kg/m2。对照2组年龄23～35(27.34±3.83)岁；孕周(35.06±1.27)周；BMI(29.22±3.78)kg/m2。各组年龄和BMI比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，对照1组与观察1组、对照2组与观察2组孕周比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究获得医院伦理委员会审核同意，入选孕妇均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：所有入组研究对象均接受剖宫产，且在娩出胎盘15 min内采集标本，取胎盘母体面的中央区域，将底部的蜕膜层剪除，垂直剪切2块大小相同的胎盘组织(约为2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm)，避开异常胎盘组织(如钙化灶、梗死区、出血处等)，将其中1块胎膜组织放于10%中性甲醛固定后送病理检查。

1.2.2 标本处理：另一块胎膜组织用0.9%氯化钠溶液将组织漂洗干净，用无菌滤纸清除组织上的血液和羊水，置入10%中性甲醛固定24 h，采用梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切成厚度为4 μm的切片，用于后续实验。(1)苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色：预热烤片箱至60℃，将切好的石蜡切片置于烤箱中烘烤0.5 h；取出石蜡切片后依次置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ液中各浸泡5 min，之后用不同浓度的乙醇脱蜡，再用自来水冲洗；将石蜡切片在苏木精溶液中染核5 min后，自来水清洗，再放置于1%的盐酸酒精液中分色1～2 s，自来水冲洗20 min后在室温下放置5～10 min使其返蓝，再放入伊红液中复染胞浆2～3 min，自来水冲洗，在不同梯度乙醇中依次浸泡5 min后再置入二甲苯Ⅰ、Ⅱ液中浸泡分别5 min，最后用中性树胶封片，于显微镜下观察。(2)免疫组化法：预热烤片箱至60℃，将切好的石蜡切片于烤箱中烘烤0.5～1 h；取出石蜡切片后常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗载玻片上多余的酒精；对石蜡切片进行微博抗原热修复后，3% H2O237℃孵育10 min，PBS冲洗3次，5 min/次，消除内源性过氧化物酶活性；正常羊血清工作液在37℃下封闭10 min后倾去封闭液，滴加稀释后的一抗，置于湿盒内4℃过夜；将石蜡切片取出，放置在室温下约30 min，PBS冲洗3次，5 min/次；滴加生物素标记的二抗工作液，37℃下放置30 min，PBS冲洗3次，5 min/次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃恒温箱内放置30 min，PBS冲洗3次，5 min/次；3,3-二甲基联苯胺盐酸盐/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，中性树胶封片，在显微镜下观察并判断免疫组化结果，分析NLRP3、TLR-2表达情况。

1.3 观察指标 (1)绒毛膜羊膜炎发生情况：绒毛膜羊膜炎的诊断标准为：① 阴道液有臭味，且存在子宫压痛、母儿心率加快、发热、白细胞计数增加等；② C反应蛋白水平>8 mg/L；③ 显微镜下胎膜病理切片可见中性粒细胞浸润，每高倍视野≥11个。(2)NLRP3、TLR-2表达情况：计数各组研究对象胎盘胎膜组织NLRP3、TLR-2表达的阳性细胞数。阳性细胞：细胞结构完整，细胞膜或细胞质中可见有棕褐色、棕黄色颗粒，细胞核为蓝色；阴性细胞：细胞核蓝色，在细胞核映衬下细胞质也为蓝色。用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件测定胎膜胎盘组织NLRP3、TLR-2的平均光密度值，胎膜胎盘组织中NLRP3、TLR-2的表达水平以图像5个阳性区积分光密度的平均值表示。

1.4 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，、多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组研究对象绒毛膜炎发生率比较 观察组绒毛膜羊膜炎发生率为47.78%(43/90)，高于对照组的8.57%(6/70)(χ2=24.488，P<0.001)；其中观察1组发生率为39.58%(13/48)，观察2组发生率为57.14%(24/42)，两组差异无统计学意义(χ2=2.768，P=0.096)。

2.2 观察组与对照组胎膜胎盘组织镜下观察结果 观察组和对照组的胎盘胎膜组织中均有NLRP3和TLR-2的表达(见图1)。胎盘组织中NLRP3主要定位在胎盘合体滋养细胞的细胞质(见图2)，胎膜组织NLRP3主要定位在间充质细胞和胎膜上皮细胞的细胞质(见图3)。胎膜组织的TLR-2主要定位在羊膜上皮细胞和绒毛膜滋养细胞，胎盘组织的TLR-2主要定位在合体滋养细胞的细胞质和细胞膜中(见图4～5)，另外也可见其在胎盘绒毛和蜕膜间质中有少量表达。对照组和观察组胎盘胎膜组织NLRP3和TLR-2的表达定位基本相同，而观察组大多细胞的细胞质中可见有明显的棕染颗粒沉着。

图1 胎盘胎膜HE染色结果(×40)

图2 胎盘组织NLRP3蛋白免疫组化染色结果(×40)

图3 胎膜组织NLRP3蛋白免疫组化染色结果(×40)

图4 胎盘组织TLR-2蛋白免疫组化染色结果(×40)

图5 胎膜组织TLR-2蛋白免疫组化染色结果(×40)

2.3 观察组与对照组胎膜胎盘组织NLRP3、TLR-2的平均光密度值比较 4组研究对象胎膜、胎盘组织NLRP3、TLR-2的平均光密度值比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中，观察1组胎膜、胎盘组织的NLRP3平均光密度值均高于其余3组，观察2组高于对照1组及对照2组(均P<0.05)；观察1组和观察2组胎膜、胎盘组织的TLR-2平均光密度值均高于对照1组和对照2组(均P<0.05)，但观察1组和观察2组TLR-2平均光密度值差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组胎膜、胎盘组织NLRP3及TLR-2的平均光密度值比较(x±s)

注：与对照1组相比，*P<0.05；与对照2组相比，#P<0.05；与观察2组相比，△P<0.05。

2.4 各组胎膜、胎盘组织NLRP3、TLR-2阳性细胞数比较 4组研究对象胎膜、胎盘组织NLRP3、TLR-2阳性细胞数比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中，观察1组患者胎膜、胎盘组织的NLRP3阳性细胞数均高于其余3组，观察2组高于对照1组和对照2组(均P<0.05)；观察1组和观察2组胎膜、胎盘组织的TLR-2阳性细胞数均高于对照1组和对照2组(均P<0.05)，但观察1组和观察2组TLR-2阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组胎膜、胎盘组织NLRP3及TLR-2阳性细胞数比较(x±s，阳性细胞数/mm2)

注：与对照1组相比，*P<0.05；与对照2组相比，#P<0.05；与观察2组相比，△P<0.05。

3 讨 论

PROM是指临产开始前包括羊膜和绒毛膜的胎膜发生破裂，可分为发生于妊娠37周后的TPROM和发生在妊娠37周以前的PPROM。PROM发生率较高，已经成为常见的威胁母婴健康的产科疾病。虽然目前国内外对PROM具体的发病机制尚未完全明确，但临床医生一致认为，PROM并不是由单一因素诱发的，导致其发生的风险因素众多，包括感染、胎位异常、头盆不对称、多胎等，而生殖道病原微生物上行感染被认为是导致其发生的关键性因素。阴道等部位的菌群通过上行渠道感染子宫颈，新生儿和母亲进一步受到感染，导致PROM，并引发子宫下段炎症和绒毛膜羊膜炎等并发症[7]。有研究指出，PROM产妇中有50%以上存在绒毛膜羊膜炎[8]。本研究结果显示，观察组产妇绒毛膜羊膜炎发生率为47.78%，高于对照组的8.57%，提示绒毛膜羊膜炎可能与PROM的发生密切相关。

PROM的病理变化是胎膜本身结构缺陷和炎症，炎症和感染不仅会损伤胎膜结构，还会影响孕妇免疫系统。机体发生感染时，炎症会诱导产生多种蛋白质分子，参与机体胎盘胎膜组织的免疫过程[9]。有学者发现，离体培养的被病原微生物感染的胎膜组织中NLRP3表达水平升高[10]。还有研究发现，正常的胎膜胎盘中NLRP3表达水平较低，而在PROM患者中高表达[11]。NLRP3是一种参与胎盘非特异性免疫的炎性体，主要存在于胎膜上皮细胞、胎盘滋养细胞、蜕膜内皮细胞及蜕膜基质细胞。本研究结果显示，胎膜组织NLRP3主要定位在间充质细胞和胎膜上皮细胞的细胞质，胎盘组织中NLRP3主要定位在胎盘合体滋养细胞的细胞质。观察组胎盘胎膜组织中NLRP3表达水平高于对照组(P<0.05)，提示NLRP3有可能参与了PROM的免疫应答过程。同时本研究还发现，观察1组患者胎盘胎膜组织NLRP3表达水平高于观察2组(P<0.05)，这可能与两组患者细胞结构成分和细胞凋亡等过程的炎性因子释放水平不同有关，但具体的机制仍需进一步探讨。

TLR是一种连接特异性免疫和非特异性免疫，并自发参与机体非特异性免疫过程的重要蛋白质分子，其属于膜结合蛋白家族，可通过识别不同光谱的病原体并生成相应信号来对异己分子产生先天性免疫反应，从而协调机体的免疫过程，在介导母胎之间的天然免疫过程中发挥重要作用[12]。TLR可通过与二聚体或其他蛋白质连接的途径来激活微生物宿主启动炎症反应的第一步-先天性免疫系统的病原体相关分子模式，进而诱导和促进炎症细胞因子的合成和释放，导致炎症反应发生。研究发现，人类胎盘组织中有10种TLR表达，主要表达在滋养细胞，而TLR-2表达范围最广、识别病原微生物及其产物种类最多[13]。TLR-2可识别支原体、革兰阳性菌、螺旋体、病毒、寄生虫、真菌等，其中真菌、淋病双球菌、滴虫等是常见的阴道和宫颈感染病原微生物[14]。研究指出，绒毛膜羊膜炎孕妇胎膜组织TLR-2表达水平高于正常晚期妊娠妇女，这与绒毛膜羊膜炎孕妇容易发生感染和早产密切相关[15]。TLR-2的大量表达会通过不同信号通路的协同作用引发胎膜分子级联反应，体内胎盘和蜕膜在这个过程中会释放分泌各种促炎细胞因子和趋化因子，最终导致PROM[16]。本研究发现，在胎膜组织中，TLR-2主要定位在的羊膜上皮细胞和绒毛膜滋养细胞，在胎盘组织中，其主要定位在合体滋养细胞的细胞质和细胞膜上，另外也可见其在胎盘绒毛和蜕膜间质中有少量表达。本研究结果显示，观察组患者的TLR-2蛋白表达水平高于对照组(P<0.05)，但观察1组和观察2组TLR-2表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，提示TLR-2可能参与了PROM的发生发展，其主要通过促进炎性因子的大量释放和炎症反应的诱导来发挥作用，但其表达水平可能与PROM孕妇的孕周无关。

综上所述，PROM产妇NLRP3、TLR-2表达水平均升高，两者可能与PROM的发生发展有关，进一步研究两者的作用机制有可能为PROM的诊断和治疗提供新的方向和途径。