多重PCR 检测耐除草剂转基因作物

邢珍娟 董立明 刘 娜 夏 蔚 李葱葱 谢彦博 李飞武

(吉林省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,吉林 长春 130033)

自1983年第一例转基因作物问世以来,全球转基因作物发展迅猛,根据国际农业生物技术应用服务组织(International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications,ISAAA)统计数据显示,2016年全球26 个国家共种植1.851 亿hm2的转基因作物,较2015年增长约3%,较1996年增加110 倍[1]。 除草剂对农田杂草具有良好的防治效果,在农事管理操作中发挥重要作用,随着各类除草剂抗性基因的挖掘及遗传改良技术的发展,耐除草剂转基因作物研发取得了显著进展,已成为全球范围内推广应用面积最大的转基因作物类型[1]。 2016年全球种植的耐除草剂转基因作物(包括抗虫和耐除草剂复合性状)约1.62 亿hm2,占转基因作物种植总面积的87.5%,较2015年增长约5%[2]。 目前,除草剂抗性基因在转基因大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜等作物中均有报道[3]。

转基因技术作为一项新型高新技术,其产品的食用安全性和环境安全性受到了广泛关注[4],因此,很多国家和地区对转基因技术及其产品建立了相应的管理法规,如安全评价制度、标识监管制度等[5]。 为确保这些监管制度的实施,国内外学者围绕转基因产品精准、快速检测技术等开展了大量研究,其中PCR 是最常应用的转基因分子检测技术,已建立了一系列以外源调控元件、标记和报告基因、目的基因、转化体成分等为靶标的单一PCR 检测方法[6-7]。

在转基因产品分子检测时,一般先对几种常见转基因成分,如外源调控元件、目的基因等进行筛查,确认样品中是否存在转基因成分,然后再进行转基因身份鉴定[8-9]。 随着转基因成分筛选元件种类的增多,采用单一PCR 方法存在操作繁琐、耗时低效、成本较高等不足,而多重PCR(multiplex PCR,MPCR)技术可在同一个检测体系中加入多种检测引物,实现对多种靶标DNA 的同时检测,显著提高了检测效率[10]。 由于MPCR 体系较以单个基因为检测对象的普通PCR更复杂,且技术难度大,因此在建立MPCR 方法时需对不同靶标的引物用量及反应条件进行优化测试,确保建立的MPCR 方法有足够的特异性和灵敏度[11-12]。近年来,大量的研究学者运用MPCR 技术对转基因产品进行分子检测,如张耀川等[13]利用MPCR 技术建立了7 种转基因油菜籽转化体的检测方法;董立明等[14]采用MPCR 技术建立了转基因大豆品系的高通量检测方法;李飞武等[15]建立了能同时检测8 种Bt 基因的多重简并PCR 方法;Xu 等[16]利用MPCR 技术结合PAGE 电泳建立了9 种外源基因和6 种内源基因的15重PCR 方法;傅凯等[17]建立了13 个转基因玉米品系的MPCR-芯片检测方法;Heide 等[18]将MPCR 与毛细管电泳结合建立了8 种转基因玉米品系的高通量检测方法。 但已报道的方法多见于对筛选元件、抗虫基因及转基因玉米、油菜等品系特异性的研究,对转基因耐除草剂作物的MPCR 检测方法尚鲜见报道。

针对耐除草剂转基因作物,以除草剂抗性基因为靶标对象的特异性检测方法是转基因产品日常监管和筛选检测的重要技术手段之一,而建立快速高效的检测方法已成为转基因分子检测技术研究的重点[5]。CP4EPSPS、bar、pat、aad1、dmo 5 个基因是当前应用最广泛的除草剂抗性基因。 本研究以含有dmo、pat、CP4EPSPS、bar 和aad1 5 个耐除草剂基因的转基因作物为试验材料,通过引物设计与筛选、MPCR 反应体系、反应条件优化、特异性检测、灵敏度测试、适用性验证等,以期建立能同时检测转基因作物中5 种除草剂抗性基因的MPCR 方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 转基因玉米( Bt11、 T25、MON88017、NK603、Bt176、DAS40278-9),转基因大豆(MON87708、MON89788、GTS40-3-2、A2704-12、A5547-127),转基因棉花(MON1445、MON88913、LLCOTTON25),转基因油菜(GT73、Topas19/2、RF1),转基因甜菜(H7-1)及非转基因作物样品均由吉林省农业科学院转基因检测实验室收集并保存。 每种转化体及适用性测试样品中含有的除草剂抗性基因信息详见表1。

表1(续)

1.1.2 主要试剂 植物基因组提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司;HS-Taq DNA 聚合酶、dNTPs等购自大连宝生物有限公司;GeneFinder 核酸染料、琼脂糖等购自北京鼎国生物有限公司。 所有引物均由上海生工生物有限公司合成和纯化。

1.2 方法

1.2.1 样品基因组DNA 的提取 取100 ～200 mg 样品粉末,利用DNA 提取试剂盒提取样品的基因组DNA,用ND1000 微量紫外/可见分光光度计(美国NanoDrop 公司)测定DNA 样品的纯度和浓度,并根据浓度测定值稀释至25 mg·L-1,4℃保存备用。

1.2.2 阳性对照DNA 样品的制备 将转基因玉米NK603、Bt176、 Bt11、 DAS40278 - 9 及 转 基 因 大 豆MON87708 的基因组DNA 等体积混合制成阳性对照DNA 样品,其中每个转化体DNA 成分的质量浓度为5 mg·L-1(相当于质量分数为20%)。

1.2.3 引物的设计及筛选 以常见除草剂抗性基因dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1 的核苷酸序列为模板[19-20],按照MPCR 引物设计原则,应用引物设计软件Primer Premier 5.0 设计上述5 个靶标基因的引物,其序列、预期扩增产物大小等信息详见表2。 用ddH2O 将引物干粉溶解并稀释至10 μmol·L-1。

1.2.4 单重PCR 扩增体系 扩增体系为25 μL,包含10×PCR 缓冲液2.5 μL, dNTPs 混合液2 μL(每种dNTP 终浓度为0.2 mmol·L-1),上、下游引物各1 μL,热启动Taq DNA 聚合酶0.25 μL(5 U·μL-1),DNA 样品2 μL,加ddH2O 补充至25 μL。 每个样品设3 次重复。

1.2.5 MPCR 扩增体系 扩增体系为25 μL,包含10×PCR 缓冲液2.5 μL, dNTPs 混合液2 μL,dmo、pat、aad1 基因的上下游引物各0.5 μL,CP4EPS 基因的上下游引物各0.75 μL,bar 基因的上下游引物各1.0 μL,热启动Taq DNA 聚合酶0.25 μL(5 U·μL-1),DNA 样品2 μL,加ddH2O 补充至25 μL。 每个样品设3 次重复。

1.2.6 扩增程序及产物检测 单一和五重PCR 采用相同的扩增程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,63℃退火30 s,72℃延伸60 s,35 个循环;72℃延伸7 min。 取7.5 μL PCR 扩增产物,用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。

2 结果与分析

2.1 引物筛选

本研究中,CP4EPSPS 基因的检测引物直接采用国家标准中的简并引物,而dmo、pat、bar 和aad1 基因则在系统分析各个检测靶标的序列信息及现有方法基础上,重新设计了适用于建立MPCR 的引物,并对新引物的特异性进行测试。 扩增结果显示,新设计的4对引物可从aad1、bar、 pat 和dmo 4 种靶基因的阳性对照样品中分别扩增出130、220、461 和627 bp 的预期产物(图1)。 为保证所设计引物序列的特异性,将设计的引物序列提交NCBI 数据库(http:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行核苷酸序列检索比对,结果显示所有引物序列与主要农作物基因组DNA 均不具有同源性,从理论上验证了引物在转基因作物检测中的特异性。

2.2 MPCR 引物适用性

为验证aad1、bar、CP4-epsps、 pat 和dmo 5 种靶基因的检测引物在MPCR 体系中的适用性,以阳性对照DNA 样品及相应的单一转化体DNA 为模板,进行五重PCR 扩增。 测试结果显示,应用此MPCR 体系在阳性对照样品中可获得5 个靶基因的预期扩增产物,而在单一转化体样品中仅获得与预期片段大小一致的单一目标产物,表明用这5 对引物建立MPCR 检测体系是可行的(图2)。

图1 新设计的4 个基因检测引物的测试结果Fig.1 Testing results of new designed primers for four herbicide-tolerant genes

图2 多重PCR 体系的适用性测试Fig.2 Applicability of the multiplex PCR

2.3 MPCR 反应体系及反应程序的优化结果

为确定MPCR 检测体系的最适引物配比和反应程序,设置3 个引物配比方案(反应体系中dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1 的引物终浓度分别为0.2、0.2、0.2、0.4、 0.2 μmol·L-1, 0.2、 0.2、 0.3、 0.4、 0.2 μmol·L-1,0.2、0.2、0.4、0.4、0.2 μmol·L-1),4 种退火温度(60、61、62、63℃),以阳性对照DNA 样品及其5倍稀释液为测试样(标记为1×和0.2×阳性DNA 样品),进行引物浓度和退火温度的二因素MPCR 正交试验。 结果表明,当dmo、pat、CP4EPSPS、bar、aad1 基因的检测引物浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.4、0.2 μmol·L-1,退火温度为63℃时,利用五重PCR 方法在2 个测试样品中均能得到5 种靶标基因的特异性扩增产物,且条带清晰均一。

2.4 MPCR 方法的灵敏度分析

将阳性对照DNA 样品用0.1×TE 进行梯度稀释,制备了8 份灵敏度测试样,测试样品中含每种靶标基因的样品DNA 质量浓度分别相当于1.25、0.5、0.25、0.125、0.05、0.025、0.012 5、0.002 5 mg·L-1,利用优化好的反应体系和反应程序进行五重PCR 扩增。 由图3 可知,当DNA 样品浓度≥0.025 mg·L-1时,可获得全部5 种靶标基因成分的特异性扩增产物,而当DNA 样品浓度≤0.012 5 mg·L-1时仅能获得部分预期扩增产物,表明该五重PCR 方法对每种靶标基因的检出限为0.025 mg·L-1。 按每个体系中加入2 μL 模板计算,本研究建立的五重PCR 方法对每种靶标基因的检出限均可达50 pg;按初始DNA 浓度25 mg·L-1测算,相对检出限为0.1%,可满足转基因作物中相应除草剂抗性基因成分的精确检测需求。

图3 MPCR 方法的灵敏度测试Fig.3 Sensitivity of the MPCR assay

2.5 MPCR 检测方法对不同组分样品的适用性

将耐除草剂转基因作物进行混合,制成含2 ～5 种靶标基因的适用性测试样品(表1),每个样品中每种靶标基因的DNA 质量浓度为0.25 mg·L-1(相当于质量分数为1%),进行MPCR 检测体系的适用性测试。由图4 可知,应用五重PCR 方法能够从11 个适用性测试样品中分别扩增到2～5 个特异性产物,在空白对照和阴性对照样品中均无扩增,且未出现假阳性或假阴性情况,与表1 所列的预期结果一致,表明本研究建立的五重PCR 方法适用于各种复杂样品中5 种除草剂抗性基因的精准检测。

3 讨论

图4 多重PCR 方法的适用性验证Fig.4 Applicability of the multiplex PCR assay

MPCR 技术作为一种经济高效、准确可靠的高通量检测手段,广泛运用于转基因成分检测,检测对象既有常见的调控元件、标记基因和目的基因[15,22-23],也有转基因玉米[24]、大豆[25-26]、油菜[13]、棉花[27-28]、番木瓜[29]等转化体成分,前者可实现筛查目的,后者可对转基因成分进行身份鉴定。 由于cp4-epsps、bar 和pat 基因在转基因作物中已被广泛长期应用,前人对CP4EPSPS、bar 和pat 基因的PCR 或ELISA 检测方法[30-31]进行了研究并形成了相应的国家标准[32,21],如龙丽坤等[33]建立了aad1 和dmo 双重PCR 检测方法。但尚未有基于高通量技术同时筛查上述5 种除草剂抗性基因的报道。 本研究针对国内外广泛应用的5 种除草剂抗性基因建立了五重PCR 检测方法,为基于外源目的基因的转基因成分筛选检测提供了一种新的技术手段。

一种可靠的高通量检测方法不仅需要有严格的特异性和灵敏度,还需具有在复杂样品中正确检出预期靶标成分的适应性。 本研究通过一系列试验建立的五重PCR 检测方法可对含CP4EPSPS、bar 等5 种靶标基因成分的单个转化体或多个转化体的混合物进行准确鉴定,对每个靶标的检测灵敏度可达0.1%,与前人报道的多重PCR 方法的技术指标一致[10,30],表明本研究新建的五重PCR 方法可作为耐除草剂转基因作物及其产品的筛查手段。

据统计,目前我国已批准进口的49 个转基因作物转化体中有34 个含有除草剂耐受性,其中30 个含有本研究中使用的除草剂抗性基因。 根据已有的试验结果及检测引物与靶标核苷酸序列的比对,本研究建立的五重PCR 方法可以对这30 个含有CP4EPSPS、bar、pat、aad1 或dmo 基因的耐除草剂作物进行筛选检测,分别占已批准进口的全部转化体和耐除草剂转化体的61.2%和88.2%。 本研究结果表明,MPCR 检测方法具有较好的检测覆盖度,是一种高效的检测手段,可为我国转基因作物监管和检测提供一定的技术支撑。

4 结论

本研究建立了以CP4EPSPS、bar、pat、aad1、dmo 5 个常见除草剂抗性基因为靶标的MPCR 检测方法,该方法具有良好的特异性,对每种靶标的检测灵敏度可达到0.1%,适用于各种复杂样品中相应转基因成分的快速高效筛查。 与现行标准中的常规PCR 方法相比,本研究建立的MPCR 方法有效提高了检测效率,降低了检测成本,进一步完善了转基因产品成分检测技术手段,在玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜等农作物及其产品的转基因成分筛选检测工作中具有较好的应用前景。