酪蛋白磷酸肽检测方法研究进展

2019-02-17 08:04邵琪魏丽娜张东丽张丽茹王为屈岩峰
食品研究与开发 2019年3期
关键词:沉淀法酪蛋白液相

邵琪,魏丽娜,张东丽,张丽茹,王为,屈岩峰,*

(1.黑龙江东方学院 食品与环境工程学部,黑龙江哈尔滨150066;2.内蒙古自治区食品药品审评查验中心,内蒙古呼和浩特010011;3.呼伦贝尔双娃乳业有限公司,内蒙古呼伦贝尔162750)

酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides,CPP),是酪蛋白经过特定的蛋白酶水解、分离纯化后得到的含有成簇的磷酸丝氨酸的生物活性肽,其生物活性中心可表示为-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-[1],这种结构的磷酸肽分子中带有高浓度的负电荷,对于CPP发挥其生理功能是必不可少的。由于CPP具有这种特殊的核心结构,既能抵抗消化道中各种酶的攻击免遭水解,又可以与钙离子结合形成可溶性络合物,从而有效地防止钙在小肠pH值呈中性或弱碱性环境下形成磷酸钙沉淀,从而促进钙在小肠中吸收[2-4]。除钙外,CPP还可促进铁、锰、锌、硒等矿物质的吸收,因此被誉为“矿物质载体”[5-7]。经过国内外科学家的大量研究表明,CPP也具有防龋齿、促进牙齿、骨骼中钙的沉积和钙化、提高繁殖性能、诱导肿瘤细胞凋亡、增强机体免疫力及促进体内益生菌增殖等营养功能[8-11]。

目前,CPP的应用相当广泛,主要应用于适合儿童、老人、孕妇等不同人群食用的各种保健食品[12],我国食品安全国家标准GB 14880-2012《食品安全国家标准-食品营养强化剂使用标准》指出CPP可应用于婴幼儿配方食品、粮食和粮食制品、饮料等,并对使用量作了明确的规定[13]。日本和德国等国早已把CPP作为功能性食品,我国多家企业也将CCP作为食品营养强化剂添加在婴幼儿奶粉和保健食品中。

近年来,关于食品中CPP含量的测定方法有很多种,但迄今国内尚无权威的、统一的检测方法。本研究针对国内外CPP检测技术的研究情况、存在的问题和研究方向分别进行阐述,不仅为食品中CPP含量测定方法的研究提供借鉴,而且对于指导同类产品中CPP含量的检测具有一定参考价值。

1 酪蛋白磷酸肽检测方法研究现状

目前,研究较多的CPP检测方法主要有氯化钡-乙醇沉淀法、毛细管区带电泳法、液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法等。这些方法均具有各自的优势,同时也有着一定的不足。

1.1 氯化钡-乙醇沉淀法

氯化钡-乙醇沉淀法是在适当的温度和pH值条件下,CPP分子间可通过钡离子(Ba2+)形成桥连,加入一定浓度的乙醇即可使桥连状的CPP分子团沉淀下来,将得到的CPP沉淀进行分离、干燥,称重后即可得出产品中CPP含量[14-15]。现行的标准GB 31617-2014《食品安全国家标准食品营养强化剂酪蛋白磷酸肽》[16]中采用此方法对CPP含量进行检测,准确度差,效果并不理想。

陈雪香等[17]对来自8个不同公司样品中CPP含量进行测定(样品纯度较低),分别采用氯化钡-乙醇沉淀法、氮磷比(N/P)法及高效液相色谱法。其中氯化钡-乙醇沉淀法利用盐酸调节样液的pH值至4.6使蛋白质溶解度降低而形成沉淀,5℃4000 r/min离心30 min,取上清液加入氯化钡溶液使CPP分子形成桥连,再加入乙醇后得到CPP沉淀。经分离、干燥后测定8个样品中CPP含量,比较8种样品测定结果得出,样品中CPP含量最低为19.43%,最高为38.01%,与N/P的结果和实际值相差较大,得出对于CPP纯度较低的样品而言,添加的其它成分导致最后测定结果有较大偏差。

张帅等[18]采用氯化钡-乙醇沉淀法测定钙片中CPP含量,参照陈雪香的方法并在此的基础上加以改进,把离心机参数调整为8000 r/min离心15 min,同时为使CPP沉淀更完全,增加了静止的时间,测定的5个样品中CPP回收率均高于220%。该方法操作繁琐费时,受pH值、沉淀时间及样品中其它可以和Ba2+离子络合的组分的影响,导致回收率有较大程度偏高,不适用于添加了各种组分的保健品中CPP含量测定。

1.2 毛细管区带电泳法

毛细管区带电泳法(capillary zone electroporesis,CZE)是毛细管电泳中最简单、也是目前应用相对较多的一种分离方式[19-21]。其分离机理是在缓冲溶液中带电粒子在电场的作用下以各自不同速度向其所带电荷极性相反方向移动形成电泳,电泳的移动和电渗流结合而使分子分离。

Adamson等[22]利用CZE分析了多组分CPP。尝试将CPP的绝对电渗流与其物理化学性质联系起来,从蛋白质消化液中选择性沉淀多个含磷酰基的肽,使用C8(5 μm,4.6 mm×220 mm)反相高效液相色谱分离纯化后,样品经0.1%的三氟乙酸(1 mg/mL)溶解,用CZE对多组分进行分析,通过测定与中性内标的相对迁移时间确定了各种肽段的绝对电渗流,获得了良好的线性关系(R2=0.993)。

王利民等[23]利用两种规格石英毛细管,不同的检测波长、缓冲液及pH值不同的缓冲液,在工作电压30 kV、柱温25℃的条件下测定CPP的含量,研究发现在使用50 cm×70 μm i.d.石英毛细管柱,检测波长设为200 nm,用pH 9.2的四硼酸钠缓冲液CPP会得到理想的分离效果。该方法操作简便、分离和测定速度快、分辨率高、重现性好、样品及缓冲液用量少、自动化程度高。但由于一些食品中的蛋白质和盐类成分会对测定结果造成干扰,故该法仅适合一些CPP制剂产品的含量测定[24]。

牟光庆等[25]用CZE对CPP进行了分离和测定。在Adamson等[20]人的基础上略加改动,样品经0.1%的浓度为50 mg/L三氟乙酸溶解,在工作电压30 kV、柱温25℃、毛细管长度50 cm、内径70 μm、紫外检测波长200 nm、缓冲液为pH 9.2的硼酸缓冲液条件下测定,得到不同N/P样品的CPP。结果表明,N/P可以反映出CPP肽链的长短和磷酸基的密度,N/P越小,CPP含量越高,但前处理过程复杂,受pH值及温度影响。

1.3 液相色谱-质谱联用法

高效液相色谱-质谱联用法(high performance liq-uid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLCMS)是目前比较成熟的一种联用技术,它将高效液相色谱可以分离不稳定组分和质谱对被测组分高度的鉴别能力结合起来[26-28],即使在检测复杂样品时,也具有良好的分离效果及较高的灵敏度[29]。

赖奕坚等[30]用HPLC-MS法,以选择离子模式分别测定CPP标准样品、空白样品以及添加1.0%CPP标样的样品,根据扫描结果选取了离子质荷比为454.3分离效果较好、不受杂质峰干扰的特征峰作为CPP的代表,用上述方法对4批次CPP样品进行分析,检出限为 1 μg/mL,在 1 μg/mL~100 μg/mL 范围内线性回归方程为y=3 074.6x+684.6,R2=0.999,回收率在96%~104%之间。该法前处理简便,专属性好,灵敏度高,可用于测定钙强化食品中CPP的含量,但是由于不同厂家的样品各异,会导致标志峰存在差异,且未对该特征峰作为CPP的代表做进一步的分析。

胡蓓等[31]利用蛋白质数据库确定酪蛋白氨基酸序列信息,通过高分辨质谱筛选出CPP原料中具有特异性的肽段,再通过多反应离子监测模式对CPP特征肽进行定量测定,依据CPP原料与CPP特征肽含量折算系数,采用同位素稀释内标法确定出样品中CPP的含量。该方法在10 mg/100 g~150 mg/100 g范围内线性关系良好,R2=0.999,回收率在96.2%~100.2%之间。与钡盐沉淀法、CZE法比较,具有前处理简单,分析速度快,灵敏度高,定量结果准确,检测限低等优点,然而其定量限为1 mg/100 g,仅适用于低含量CPP的检测,并需要使用较为大型、昂贵的仪器,测试成本较高。

1.4 高效液相色谱法

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)是以液体作为流动相,色谱柱为固定相,待测样品在流动相的携带下进入色谱柱,并基于被测组分在两相间具有不同的吸附能力来达到分离的目的[32-34]。目前,对于CPP的分离检测技术,高效液相色谱法应用比较普遍。比如,张帅等[16]还用HPLC法分析了钙片中CPP的含量,样品处理后,以三氟乙酸(TFA)水溶液及含有机相为5%~35%的TFA乙腈溶液为流动相梯度淋洗,检测波长为215 nm,选用C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)色谱柱和紫外检测器测定。在此条件下,CPP分离效果良好,检出限为6.81 μg/mL,回收率为96.75%~104.07%,说明HPLC法准确度和灵敏度较高。

Miquel[35]等利用高效液相色谱仪对CPP中可能影响矿物质利用的磷酸丝氨酸残基序列鉴定,色谱柱为C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),样品能得到较好的分离效果,对β-酪蛋白水解产生的CPP能够准确的定量。Kosalkova[36]等也试图采用HPLC法对食品中CPP含量的检测方法进行研究。

田随安等[37]用HPLC对保健食品中CPP含量进行测定。以乙腈和0.1%冰乙酸溶液作为流动相梯度洗脱,柱温25℃,色谱柱为Diam onsil C18250mm×4.6mm,由于样品在240 nm和280 nm下都有紫外吸收,对比发现检测波长为280 nm时不易受流动相干扰,并在此最佳波长下测定样品,得到最低检出限为10 μg/mL,回收率在91%~103%之间,相对标准偏差为3.2%,适用于保健食品中CPP含量的测定。

刘玉娟等[38]把经过温水溶解的乳粉样品超声提取、离心后用高效液相色谱分析。采用ODS(125 mm×4.0 mm)色谱柱分离,并对经常使用的两种流动相有乙腈-0.1%乙酸水溶液或乙腈-0.1%三氟乙酸水溶液进行对比,结果表明,以乙腈-0.1%乙酸水溶液作流动相梯度洗脱时,峰型较好,故选用该流动相,用紫外检测器对样品检测。检出限为6.25 mg/kg,线性范围为5.0 μg/mL~100.0 μg/mL,加标回收率为 71.4%~94.2%,方法样品前处理简单,检测结果符合定性定量要求,适合奶粉中CPP含量的检测。

梁艳等[39]以CPP原料作为标准品,通过测定样品中CPP的质量分数来确定CPP的含量。样品经提取、净化后,采用Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,以一定比例的乙酸-甲醇溶液和乙酸-水溶液进行梯度洗脱,在紫外检测器波长为280 nm的最佳条件下测定乳制品CPP含量。两种样品的相对标准偏差分别为3.68%和1.89%,回收率为96.0%和97.1%,该方法能将样品中的CPP较好的分离出来,准确度与重现性良好,适用范围广。

1.5 其他分析方法

庞广昌等[40]为找到适合不同层次CPP含量测定的方法,对直接定磷法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)法及聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric focusing electrophoresis,IFE)法进行研究,发现这3种方法在不同的情况下,都可以测定CPP含量。直接定磷法前处理简便,重现性好,适用于产业CPP含量测定,但由于一些含有磷酸的肽也包含在内,会得到一个偏高的结果,故用此方法前必须要测定样品中的无机磷及非蛋白磷;SDS-PAGE法操作较为复杂,且电泳图谱中含磷带与不含磷带无明显分界,在切下含磷带时往往会混入其它肽,导致CPP含量较高,仅适用于CPP组分测定,但不需测定样品中的无机磷及非蛋白磷;IFE法测定CPP含量,准确度高、重现性及稳定性好,适用于较精确的测定,但需要昂贵的实验设备及药品。

2 酪蛋白磷酸肽检测面临的困难与发展方向

2.1 食品成分复杂

食品的种类多样,其组成基质复杂,除碳水化合物、脂肪、蛋白质等主要营养物质外,大多数添加CPP的产品中还含有盐类、无机磷及少量非蛋白质含磷物等多种化学物质,对检测过程中样品(尤其是钙强化食品)的准确定量造成了一定程度上的干扰。

2.2 检测技术的局限性

虽然CPP含量的检测方法有很多种,但由于CPP产品成分复杂,有些方法在应用到食品中CPP的测定存在一定的局限性。氯化钡-乙醇沉淀法中一些非CPP的组分也可以和Ba2+结合形成络合物,专属性差,使测定值高于实际值,只能用于单一CPP产品含量测定;CZE法在适当的条件下可以得到很好的分离效果且有良好的重现性,但受蛋白质和盐类物质干扰较大;CPP经酶水解制得,无固定分子量,HPLC-MS法对CPP含量的监测存在一定难度。

2.3 CPP检测技术发展方向

相对于高效液相色谱-质谱联用法、毛细管区带电泳法、氯化钡-乙醇沉淀法等检测技术,HPLC法克服了食品成分复杂的局限性,具有前处理简单、快速、专属性好、灵敏度高等优点,但在实际应用中仍然有较多问题。就添加了CPP的婴幼儿配方奶粉而言,测定过程中无市售标准品,需要以CPP原料为对照品对CPP含量进行测定,由于样品生产厂家有所不同的,会导致不同样品的标志峰及其含量会存在差异。虽然使用HPLC法检测部分产品CPP含量受到标准品的限制,但鉴于CPP的定性定量检测都优于以上方法,可以作为未来CPP检测研究方向。

3 结论

CPP在食品工业的应用中具有广阔的前景,作为迄今为止发现的唯一具有促进钙吸收作用的活性肽,多用于婴幼儿配方食品、乳制品、保健品等食品中。目前,CPP在我国还属于新兴行业,生产CPP原料的企业很少且尚未达到规模,检测技术的研究也存在一定程度上的难度,从而使CPP在食品工业中的应用受到了限制。但随着人们生活水平日益提高,在食品中添加一定量的CPP越来越会受到消费者的重视,并将成为一种趋势,故研究CPP的定量检测技术在保证食品安全方面具有十分重要的意义。虽然目前国内外CPP含量的检测方法有很多种,但大多存在操作复杂、分析时间长、准确度不高及设备昂贵等问题。而HPLC法作为一种现代仪器分析手段有方便、快捷、准确度和灵敏度高等其他方法无法比拟的优点,在食品中CPP的定量测定中运用日趋广泛并得到了一些学者的认可,可以较好的满足CPP含量的测定需要,所以只要对阻碍HPLC法发展的适于不同食品测定的CPP标准品加以开发利用,则可作为未来研究开发食品中统一的CPP检测方法国家标准的发展方向。

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